Temel ve İleri Moleküler Biyoloji Yöntemleri Genomik ve Proteomik Analizler

21.D
HeLa Hücre Kültüründe Oksidatif Stres ile Oluşturulan
DNA Hasarının qPCR ile Belirlenmesi
Özlem EROL TINAZTEPE
Gerçek zamanlı PCR ya da kantitatif PCR (qPCR) analizi, hedef dizideki DNA hasarlarının DNA polimerazın iş
görmesini engelleyerek, PCR sonucu oluşacak ürün miktarını düşürmesi temeline dayanır (bkz. Bölüm 21). qPCR ile
hem nükleus hem de mitokondri DNA’sındaki hasarlar belirlenebilir. Ürün miktarındaki azalmayı belirleyebilmek için
her bir DNA örneğinden eşit miktarda kullanmak ve reaksiyonu ürün miktarının üssel artış gösterdiği evre içindeki
bir döngüde (Şekil 1 ve Şekil 2) sonlandırmak gerekir (Grimaldi ve ark., 2002). Kalıp DNA miktarının fazla olması üssel
evreden çıkılmasına ve yanlış sonuçların elde edilmesine neden olabilir. Kalıp miktarına göre PCR ürünlerindeki lineer
azalmayı görmek ve reaksiyonun işleyişini kontrol edebilmek için her bir reaksiyonda bütün kalıplar için DNA’ların
normale göre yarısının (50 ng) kalıp olarak kullanıldığı birer reaksiyonun da yapılması önerilir (Yakes ve van Houten,
1997). qPCR analizi için DNA izole edilirken DNA’da ek hasarlara sebep olmayacak, yüksek molekül ağırlığına sahip
total genomik DNA izolasyonuna izin veren kitler (Örneğin, GenElute Memeli Genomik DNA İzolasyon Kiti, Sigma)
kullanılır.
HeLa Hücre Kültüründe Oksidatif Stres Oluşturulması
Materyal
HeLa hücreleri
(%5 CO 2
sağlayan etüvde, 37 o C’da üretilir ve 3 günde bir alt kültürleme işlemi yapılır.)
Gerekli Malzemeler
PBS (Dulbecco’nun Fosfat Tamponu)
H 2
O 2
750 mM
Tripsin-EDTA
%0.2 Tripsin
%0.04 EDTA
6 kuyucuklu kültür kapları
Hemositometre
15 mL’lik steril plastik tüpler
Besiyeri
Streptomisin (0.1 mg/mL), penisilin (100 ünite/mL), amfoterisin (0.25 µg/mL), %10 fetal sığır serumu (FBS) içeren
MEM (“Minimum Essential Medium”) (pH 7.4).
Yöntem
1. Yeni bir kültür kabında alt kültürleme yapılmadan önce hücreler bir hemositometre yardımıyla sayılır ve 6
kuyucuklu kültür kabının her bir kuyucuğunda 5 mL (10 5 hücre/mL) olacak şekilde yeni bir kültür kabına aktarılır.
2. Alt kültürü yapılan hücreler etüvde (37 o C, %5 CO 2
) 72 saat inkübe edildikten sonra besiyeri uzaklaştırılır ve
hücreler PBS ile yıkanır.
3. Hücreler PBS ile sulandırımı yapılan 750 mM H 2
O 2
’in 5 mL’si ile 60 dakika inkübe edilerek oksidatif stres oluşturulur.
4. İnkübasyon sonunda hücreler PBS ile yıkanır.
5. Üzerine 150 mL tripsin-EDTA çözeltisi eklenmiş hücreler etüvde (37 o C, %5 CO 2
) 15 dakika inkübe edilir.
6. İnkübasyon sonunda tripsin enziminin aktivitesini yok etmek için 5 mL besiyeri eklenir ve hücre süspansiyonu
steril tüpe aktarılır.
435