Temel ve İleri Moleküler Biyoloji Yöntemleri Genomik ve Proteomik Analizler
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
14<br />
DNA/DNA in situ Melezleme:<br />
Kromozomlarda Floresan in situ<br />
Melezleme (FISH) Yöntemi<br />
• • • •<br />
Selma YILMAZER, R.Dilhan KURU<br />
DNA/DNA in situ melezlemesi (“In Situ Hybridization”, ISH), özgün bir DNA dizisinin işaretli problar (sondalar)<br />
aracılığıyla kromozomlarda (metafaz yayma preparatlarında <strong>ve</strong>ya interfaz nükleusunda) gösterilmesini sağlayan<br />
güçlü bir tekniktir. Özgün DNA dizilerinin kromozomlar üzerinde yerleştiği yeri belirlemek <strong>ve</strong> kromozomların fiziksel<br />
haritasını çıkarmak için kullanılır. Kromozomal ISH, denatürasyona uğratılmış kromozomal DNA’daki hedef dizinin<br />
işaretli bir probla melezlenmesi işlemi olup, gen <strong>ve</strong> genom yapı, işlev, organizasyon <strong>ve</strong> evriminin aydınlatılması<br />
konularında önemli katkılar yapmıştır. DNA dizi bilgisinin kromozom yapısı <strong>ve</strong> gen anlatımıyla ilişkilendirilmesini<br />
mümkün kılmış <strong>ve</strong> böylece sitogenetikte geniş bir uygulama alanı bulmuştur.<br />
Belirli genlerin <strong>ve</strong>ya DNA dizilerinin kromozomlar üzerinde haritalanması için en çok kullanılan yöntemlerden biri<br />
olan ISH’nın metafaz yayma preparatlarına uygulanmasıyla ilgilenilen genler insan kromozomları üzerinde doğrudan<br />
görüntülenebilmektedir. Teknik sadece insan gen haritası için bir temel oluşturmakla kalmamış, aynı zamanda<br />
genetik hastalıklara <strong>ve</strong> kansere neden olan genlerin <strong>ve</strong>ya ilgilenilen herhangi bir genin moleküler klonlanması<br />
için de önemli bir <strong>ve</strong>ri tabanı sağlamıştır. Ek olarak metafazda, interfazda <strong>ve</strong> mayozda DNA dizilerinin yerleşimini<br />
araştırmak, evrim sırasında, gelişim sırasında <strong>ve</strong> hastalık koşullarında kromozomların yeniden düzenlenmelerini <strong>ve</strong><br />
dizi kopya sayısındaki değişikliklerini göstermek için kullanılmaktadır.<br />
Yöntemin ilk uygulamalarında tek kopyalı genler radyoaktif işaretli (H 3 <strong>ve</strong>ya P 32 ) problar ile işaretlendikten sonra<br />
otoradyografi yöntemiyle gösterilmiştir. Radyoaktif tekniğin içerdiği birtakım sorunlar nedeniyle daha sonraki<br />
yıllarda radyoaktif işaretli problarla aynı duyarlılık <strong>ve</strong> çözünürlüğe sahip izotopik olmayan moleküllerin kullanıldığı<br />
yöntemler bulmak için harcanan yoğun çabalar sonucu florokromlar <strong>ve</strong>ya biotin <strong>ve</strong> digoksigenin gibi diğer işaretleyici<br />
moleküller prob işaretlemede kullanılmaya başlanmıştır (bkz. Tablo 13.2). Biotin <strong>ve</strong> digoksigeninin görüntülenmesi<br />
için floresan işaretli antikorlar kullanılarak immünositokimyasal yöntemler uygulanmıştır. Prob, floresan boyalarla<br />
işaretlenmiş ise teknik floresan in situ melezleme (“Fluorescent In Situ Hybridization”, FISH) adını alır. Günümüzde<br />
kromozomal ISH için kullanılan yöntemlerin hemen tümü FISH yönteminden kökenlenir. Bu yöntem Pinkel <strong>ve</strong> ark.<br />
tarafından geliştirilmiştir.<br />
Floresan işaretli problar kullanıldığında kromozom yaymasındaki melezlenme noktalarını görüntülemek için<br />
floresans mikroskobu gereklidir (bkz. 1.2.13). FISH’de prob işaretleyiciler, doğrudan proba bağlanan florokromlar<br />
<strong>ve</strong>ya floresan işaretli reaktifler <strong>ve</strong> antikorlarla belirlenebilen biotin <strong>ve</strong> digoksigenin gibi diğer moleküller olabilir.<br />
Kromozomal ISH, FISH tekniğinin kullanıma girmesiyle birlikte çok önemli bir aşama kaydetmiştir. Kromozomal hedef<br />
dizilere uygulanan DNA in situ melezlemesi günümüzde FISH ile eş anlamlı olarak kullanılmaktadır. Melezlenme<br />
sinyallerinin floresan yöntemle gösterilmesi diğer yöntemlere göre çözünürlük, kontrast, hızlı <strong>ve</strong> gü<strong>ve</strong>nli kullanım<br />
179
Change language