Temel ve İleri Moleküler Biyoloji Yöntemleri Genomik ve Proteomik Analizler
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
TEMEL <strong>ve</strong> İLERİ<br />
MOLEKÜLER BİYOLOJİ YÖNTEMLERİ<br />
GENOMİK <strong>ve</strong> PROTEOMİK ANALİZLER<br />
EDİTÖRLER<br />
Prof. Dr. Güler TEMİZKAN<br />
İstanbul Üni<strong>ve</strong>rsitesi Fen Fakültesi<br />
<strong>Moleküler</strong> <strong>Biyoloji</strong> <strong>ve</strong> Genetik Bölümü<br />
Emekli Öğretim Üyesi<br />
Prof. Dr. Nazlı ARDA<br />
İstanbul Üni<strong>ve</strong>rsitesi Fen Fakültesi<br />
<strong>Moleküler</strong> <strong>Biyoloji</strong> <strong>ve</strong> Genetik Bölümü<br />
Biyoteknoloji <strong>ve</strong> Genetik Mühendisliği<br />
Araştırma <strong>ve</strong> Uygulama Merkezi (BİYOGEM)<br />
NOBEL TIP KİTABEVLERİ
ÖNSÖZ<br />
• • • •<br />
Daha önce Nobel Tıp Kitabevleri tarafından yayımlanan <strong>ve</strong> alanındaki uygulamalara ilişkin kapsamlı<br />
teorik <strong>ve</strong> pratik bilgiler <strong>ve</strong>ren “<strong>Moleküler</strong> <strong>Biyoloji</strong>de Kullanılan Yöntemler” adlı kitabımız araştırmacıların<br />
gösterdikleri yoğun ilgi nedeniyle üç baskı yaptıktan sonra hızla tükenmişti. Kitabın yeni baskısını<br />
çıkarmayı düşündüğümüzde, ilk baskısını yaptığımızdan bu yana moleküler biyoloji <strong>ve</strong> biyoteknolojide<br />
baş döndürücü bir hızla artan bilgi birikimi <strong>ve</strong> sürekli geliştirilen yeni yöntemler bizi zorunlu olarak daha<br />
geniş kapsamlı bir kitap hazırlamaya yöneltti. Bu amaçla, ilk kitabımızda var olan bölümlerin içeriğini<br />
zenginleştirmenin yanı sıra yazar sayısını da artırarak yeni <strong>ve</strong> güncel konular ekledik. <strong>Moleküler</strong> biyolojide<br />
kullanılan yöntemlerin hepsini bir kitap içerisinde toplamak kuşkusuz mümkün olmamakla birlikte,<br />
bu yeni eserde özellikle rekombinant DNA teknolojisi, genom <strong>ve</strong> proteom analizleri, omik teknolojiler<br />
<strong>ve</strong> biyoenformatiğe ait temel teorik bilgileri <strong>ve</strong> uygulama örneklerini sunmaya çalıştık. Ortaya çıkan<br />
bu eser, her biri alanlarında uzman bilim insanları tarafından yazılmış 37 bölümden oluşmakta olup<br />
moleküler biyolojide kullanılan klasikleşmiş <strong>ve</strong> yeni yöntemlere ilişkin teorik bilgiler ile birçoğu yazarları<br />
tarafından da laboratuvarda uygulanmakta olan teknikleri <strong>ve</strong> deneyimleri kapsamaktadır. Bu nedenle<br />
neyi niçin yaptığını bilmek isteyen araştırmacılar için iyi bir kaynak olacağını <strong>ve</strong> özellikle uygulama<br />
örneklerinde yer alan ipuçlarıyla da kullanıcılara pratikte yarar sağlayacağını düşünüyoruz.<br />
Gerek teknik bilgi birikiminin oluşum sürecinde çalışmalarıyla, gerekse kitabın hazırlanmasında<br />
yardımlarıyla destek olan araştırma görevlilerine <strong>ve</strong> lisansüstü öğrencilerine teşekkür ederiz. Aynı<br />
şekilde, basım <strong>ve</strong> yayım sürecinde her zaman yanımızda olan Nobel Tıp Kitabevleri’ne, oldukça uzun<br />
süren hazırlık sırasında yazım işlemlerini hiç yorulmadan, büyük bir titizlik, sabır <strong>ve</strong> güler yüzlülükle<br />
gerçekleştiren Hakkı ÇAKIR’a teşekkürü borç biliriz.<br />
Bu eserin de moleküler biyolojiye ilgi duyan <strong>ve</strong> bu güncel bilim dalının kapsadığı çeşitli konularda<br />
çalışan araştırmacıların, ilgili alanlarda öğrenim gören lisans <strong>ve</strong> lisansüstü öğrencilerinin zevkle okuyup<br />
yararlanacağı bir başvuru kitabı olmasını dileriz.<br />
Prof. Dr. Güler TEMİZKAN<br />
Prof. Dr. Nazlı ARDA<br />
Aralık 2017<br />
iii
İÇİNDEKİLER<br />
• • • •<br />
1. <strong>Moleküler</strong> <strong>Biyoloji</strong>de Kullanılan Yöntemlere Genel Bakış 1<br />
Güler TEMİZKAN<br />
1 1 Parçalama (Homojenizasyon) <strong>Yöntemleri</strong> 3<br />
1 1 1 Fiziksel Yöntemler 5<br />
1 1 2 Kimyasal Yöntemler 6<br />
1 2 Ayırma, Saflaştırma <strong>ve</strong> Analiz <strong>Yöntemleri</strong> 7<br />
1 2 1 Süzme 7<br />
1 2 2 Diyaliz 7<br />
1 2 3 Dondurarak Kurutma (Liyofilizasyon) 9<br />
1 2 4 Çöktürme 10<br />
1 2 5 Enzim Uygulaması 10<br />
1 2 6 Santrifüjleme 10<br />
1 2 7 Kromatografi 18<br />
1 2 8 Elektroforez 26<br />
1 2 9 Spektral Yöntemler 33<br />
1 2 10 Radyoizotopların Kullanımı 39<br />
1 2 11 İmmünolojik Yöntemler 42<br />
1 2 12 Nükleik Asit Mele zlemesi 43<br />
1 2 13 Mikroskobik Yöntemler 43<br />
1 2 14 Yapı <strong>Analizler</strong>i 49<br />
1 2 15 İşlev <strong>Analizler</strong>i 55<br />
1 2 16 <strong>Moleküler</strong> Etkileşim <strong>Analizler</strong>i 56<br />
1 3 Biyoinformatik 66<br />
NÜKLEİK ASİTLERİN İZOLASYON <strong>ve</strong> ANALİZİ 69<br />
2. Güncel Organizmalardan DNA İzolasyonu 71<br />
Ayşegül TOPAL SARIKAYA<br />
2 1 Bakterilerden Genom (Kromozom) DNA’sı İzolasyonu 73<br />
2 2 Bakteriyofaj DNA’sı İzolasyonu 74<br />
2 3 Mayalardan Kromozom DNA’sı İzolasyonu 75<br />
2 4 Memelilerden Kromozom DNA’sı İzolasyonu 78<br />
2 4 1 Kan Hücrelerinden DNA İzolasyonu 78<br />
2 4 2 Ağız Mukozasından <strong>Genomik</strong> DNA İzolasyonu 79<br />
2 5 Bitkilerden DNA İzolasyonu 79<br />
2 6 Plazmid DNA’sı İzolasyonu 80<br />
2 7 Mitokondri DNA’sı İzolasyonu 81<br />
v
vi<br />
İçindekiler<br />
3. Fosillerden DNA İzolasyonu 83<br />
Ercan ARICAN<br />
3.1. Fosiller <strong>ve</strong> Antik DNA 83<br />
3.2. Arkeolojide Kullanılan Diğer <strong>Biyoloji</strong>k Moleküller 85<br />
4. Kriminal Örneklerden DNA İzolasyonu 87<br />
Ayşegül TOPAL SARIKAYA<br />
5. Maternal Kandan Hücre Dışı Serbest Fetal DNA İzolasyonu 91<br />
Tuba GÜNEL<br />
6. DNA Replikasyon Kinetiği Analizi 93<br />
Cenk KIĞ<br />
7. DNA Hasarları <strong>ve</strong> Tayin <strong>Yöntemleri</strong> 103<br />
Melek ÖZTÜRK, Matem TUNÇDEMİR<br />
7.1. TUNEL Yöntemi 103<br />
7.2. Komet Yöntemi (Tek Hücre Jel Elektroforezi) 109<br />
8. Total RNA <strong>ve</strong> mRNA İzolasyonu 113<br />
Ayşegül TOPAL SARIKAYA<br />
8.1. Gram (-) Bakterilerden Total RNA İzolasyonu 114<br />
8.2. Gram (+) Bakterilerden Total RNA İzolasyonu 115<br />
8.3. Mayalardan Total RNA İzolasyonu 116<br />
8.3.1. Cam Boncuk Kullanarak Yapılan RNA İzolasyonu 116<br />
8.3.2. Cam Boncuk Kullanmadan Hızlı <strong>ve</strong> Basit RNA İzolasyonu 117<br />
8.4. Memeli Dokularından Total RNA İzolasyonu 117<br />
8.5. Bitkilerden Total RNA İzolasyonu 118<br />
8.6. Mitokondri RNA’sı İzolasyonu 119<br />
8.7. mRNA İzolasyonu 120<br />
9. siRNA <strong>ve</strong> miRNA İzolasyonu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123<br />
Tuba GÜNEL<br />
10. Nükleik Asitlerin Analizi 127<br />
Ayşegül TOPAL SARIKAYA<br />
10.1. Spektral Analiz 127<br />
10.1.1. UV-Spektrofotometrik Yöntem 127<br />
10.1.2. Floresans <strong>Temel</strong>li Yöntem 128<br />
10.2. Kromatografik Yöntemler 128<br />
10.3. Elektroforetik Yöntemler 129<br />
10.3.1. Agaroz Jel Elektroforezi 129<br />
10.3.2. Değişken Alanlı Jel Elektroforezi 130<br />
10.3.3. Poliakrilamid Jel Elektroforezi 131<br />
10.3.4. Kapiler Elektroforez 132<br />
10.3.5. RNA’nın Elektroforetik Analizi 132
İçindekiler<br />
vii<br />
11. Nükleik Asitlerin İşaretlenmesi 139<br />
Ayşegül TOPAL SARIKAYA<br />
11.1. Radyoaktif İşaretleme 139<br />
11.2. Enzimatik İşaretleme 140<br />
11.3. Floresan İşaretleme 142<br />
12. Nükleik Asit Melezleme <strong>Yöntemleri</strong> 145<br />
Ayşegül TOPAL SARIKAYA<br />
12.1. Nükleik Asit Melezlemesinin İlkeleri 146<br />
12.2. Nokta Damgalamasıyla Melezleme 147<br />
12.3. Southern Damgalamasıyla Melezleme 147<br />
12.4. Northern Damgalamasıyla Melezleme 148<br />
12.A.<br />
Southern Melezleme: HyHel 10 ScFv Geninin<br />
Prob Olarak İşaretlenmesi <strong>ve</strong> Belirlenmesi 149<br />
Şule ARI<br />
12.B. Northern Melezleme: Genel Uygulama Örneği 157<br />
Ayşegül TOPAL SARIKAYA<br />
13. In situ Melezleme 161<br />
Selma YILMAZER, Melek ÖZTÜRK, Fatma KAYA DAĞISTANLI<br />
13.1. ISH İçin <strong>Biyoloji</strong>k Materyal Hazırlama 162<br />
13.1.1. Dokunun Sabitlenmesi (Fiksasyonu) 162<br />
13.1.2. Lamların Hazırlanması 163<br />
13.1.3. Kesit Alma 163<br />
13.1.4. Bütün Halinde Hazırlanan Preparatlar 163<br />
13.1.5. Materyale Uygulanan Ön İşlemler 164<br />
13.2. Denatürasyon, Melezleme <strong>ve</strong> Yıkamalar 164<br />
13.2.1. Melezleme Öncesi (Prehibridizasyon) İşlemleri 164<br />
13.2.2. Denatürasyon 165<br />
13.2.3. Melezleme (Hibridizasyon) 165<br />
13.2.4. Melezlenme Sonrası (Posthibridizasyon) Yıkamaları 165<br />
13.3. In situ Melezleme Bölgelerinin Saptanması 166<br />
13.4. In situ Melezleme Problarının Seçimi 169<br />
13.4.1. Prob Tipleri 169<br />
13.4.2. Prob Uzunluğu 170<br />
13.4.3. Probun İşaretlenmesi 170<br />
13.5. In situ Melezlemede Kontrol 172<br />
13.6. In situ Melezlemede Ortaya Çıkan Sorunlar <strong>ve</strong> Çözümleri 173<br />
14. DNA/DNA in situ Melezleme: Kromozomlarda Floresan in situ Melezleme<br />
(FISH) Yöntemi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 179<br />
Selma YILMAZER, R. Dilhan KURU<br />
14.1. FISH Yönteminin <strong>Temel</strong>leri 180<br />
14.2. FISH Yönteminin Teknik Yönleri 182
viii<br />
İçindekiler<br />
15. Rekombinant DNA Teknolojisi 195<br />
Güler TEMİZKAN, Nermin GÖZÜKIRMIZI<br />
15.1. Gen Klonlaması Aşamalarında Kullanılan <strong>Temel</strong> Yöntemler 196<br />
15.1.1. Hücrelerden Nükleik Asit Moleküllerinin İzolasyonu 196<br />
15.1.2. Gen İzolasyonu 196<br />
15.1.3. Rekombinant DNA Moleküllerinin Oluşturulması 203<br />
15.1.4. Rekombinant DNA Moleküllerinin Konak Hücrelere Sokulması 225<br />
15.1.5. Klonlama Stratejileri 231<br />
15.1.6. Tarama <strong>ve</strong> Rekombinantların Seçilimi 238<br />
15.1.7. Klonlanan Genlerin Yerleşim <strong>ve</strong> Yapısının Tanımlanması 246<br />
15.2. Klonlanmış Genlerin Yabancı Konakta Anlatımı<br />
(Rekombinant Protein Üretimi) 253<br />
15.2.1. Anlatım (Ekspresyon) Vektörleri 253<br />
15.2.2. Kaset Vektörler 256<br />
15.2.3. Gelişmiş Yapılı Ökaryotlarda Anlatım Vektörleri 258<br />
15.2.4. Rekombinant Proteinlerin Konak Hücrelerdeki Kararlılığı 259<br />
15.3. Transkriptom <strong>Analizler</strong>i 260<br />
15.4. Gen Anlatımı Düzenlenmesinin Analizi 263<br />
15.4.1. DNA-Protein Komplekslerinin Jelde Gecikme Tekniğiyle Belirlenmesi 263<br />
15.4.2. DNazI ile Ayakizi Analizi 263<br />
15.4.3. Modifikasyon Engellemesi Yöntemi 264<br />
15.4.4. Delesyon Analizi 264<br />
15.4.5. Maya Tekli <strong>ve</strong> İkili Melez Sistemleri 267<br />
15.5. <strong>Proteomik</strong> <strong>Analizler</strong> 267<br />
15.5.1. HRT <strong>ve</strong> HART <strong>Yöntemleri</strong> 267<br />
15.5.2. In vitro Mutagenez (Yere Özgü Mutagenez) 269<br />
15.5.3. Protein-Protein Etkileşimlerinin Analizi 273<br />
15.6. Protein Mühendisliği 273<br />
15.A. Bakteri Transformasyonu 277<br />
Ayşegül TOPAL SARIKAYA<br />
15.B.<br />
Schizosaccharomyces pombe İnozin Monofosfat Dehidrogenaz (gua1)<br />
Geninin Klonlanması 281<br />
Semian KARAER UZUNER, Güler TEMİZKAN<br />
16. DNA’nın Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ile Çoğaltılması 291<br />
Şule ARI<br />
16.1. PCR’nin Mekanizması 292<br />
16.2. PCR’nin <strong>Temel</strong> Bileşenleri 293<br />
16.3. PCR’nin İşleyişi 300<br />
16.4. PCR ile Doğru Ürünün Çoğaltılması 301<br />
16.4.1. PCR Ürünlerinin Belirlenmesi <strong>ve</strong> Analizi 301<br />
16.4.2. PCR’de Bulaşmadan Korunma 302<br />
16.5. PCR Çeşitleri 303<br />
16.5.1. Yuvalanmış PCR 303<br />
16.5.2. Demirlenmiş PCR 303<br />
16.5.3. Geri Transkripsiyon PCR’si 303<br />
16.5.4. Asimetrik PCR 303<br />
16.5.5. Ters PCR 304
İçindekiler<br />
ix<br />
16.5.6. In situ PCR 305<br />
16.5.7. Çoklu PCR 305<br />
16.5.8. Rastgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA 305<br />
16.5.9. İmmüno PCR 305<br />
16.6. PCR Teknolojisindeki Gelişmeler <strong>ve</strong> Yeni Nesil PCR Çeşitleri 306<br />
16.6.1. Mikrosistem PCR 306<br />
16.6.2. Dijital PCR 307<br />
16.6.3. Hızlı PCR <strong>ve</strong> Erime Analizi 307<br />
GENOMİK ANALİZLER 313<br />
17. Genom Haritalama <strong>ve</strong> Dizileme <strong>Yöntemleri</strong> 315<br />
Şule ARI<br />
17.1. Genom Haritalama <strong>Yöntemleri</strong> 316<br />
17.1.1. Haritalama Çalışmalarında Kullanılan Genetik Belirteçler 317<br />
17.1.2. Genetik Haritalama <strong>Yöntemleri</strong> 319<br />
17.1.3. Bakterilerde Genetik Haritalama <strong>Yöntemleri</strong> 325<br />
17.1.4. Fiziksel Haritalama <strong>Yöntemleri</strong> 327<br />
17.2. Genom Dizileme <strong>Yöntemleri</strong> 332<br />
17.2.1. DNA Dizileme Metodolojisi 333<br />
17.2.2. Birinci Nesil Dizileme <strong>Yöntemleri</strong> 335<br />
17.2.3. Yeni Nesil Dizileme (YND) <strong>Yöntemleri</strong> 343<br />
17.2.4. Genom Dizileme <strong>Yöntemleri</strong> 351<br />
18. Transkriptom Analizinin İşlevsel <strong>Genomik</strong>teki Yeri 359<br />
Gülruh ALBAYRAK<br />
18.1. Anlatımı Yapılan Dizi Etiketlerinin (EST) Analizi 360<br />
18.2. Farklılık Gösterimi 362<br />
18.3. Kayıplı Melezleme 363<br />
18.4. Anlatımsal Farklılık Analizi 365<br />
18.5. Gen Anlatımının Seri Analizi 366<br />
18.6. Kitlesel Paralel İmza Dizilemesi 367<br />
18.7. Karşılaştırmalı <strong>Genomik</strong> Melezleme 369<br />
18.A.<br />
Elisitörle Tetiklenebilen Sitokrom P450 Genlerinin Astragalus<br />
chrysochlorus’da Hedeflenmiş Farklılık Gösterimi<br />
(“Differential Display”, DD) ile İncelenmesi 371<br />
Neslihan TURGUT KARA<br />
18.B.<br />
Patates Yumrusunda SAGE <strong>ve</strong>/<strong>ve</strong>ya long-SAGE Yöntemiyle<br />
Transkriptom Analizi 379<br />
Gülruh ALBAYRAK
x<br />
İçindekiler<br />
19. siRNA’lar ile Kültürdeki Hücrelerde Transkripsiyon Sonrası Gen Susturulması 391<br />
Duygu GEZEN AK, Erdinç DURSUN, Selma YILMAZER<br />
19.1. RNA Engellemesi <strong>ve</strong> Küçük RNA’lar 391<br />
19.2. siRNA’lar ile Gen Susturulması 391<br />
19.3. siRNA’ların Kültürdeki Memeli Hücrelerine Aktarılması 392<br />
19.4. Kültür Hücrelerinde siRNA’lar ile Gen Susturulması Yöntemi 392<br />
20. miRNA Anlatım Analizi <strong>Yöntemleri</strong> 395<br />
Tuba GÜNEL<br />
21. Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qPCR) ile<br />
Gen Anlatımının Analizi 399<br />
Filiz GÜREL<br />
21.1. qPCR’nin İşleyiş Mekanizması 400<br />
21.1.1. TaqMan Tekniği ile qPCR 400<br />
21.1.2. DNA’ya Bağlanan Floresan Boyalarla qPCR 401<br />
21.2. Diğer Yaklaşımlar 403<br />
21.3. qPCR’nin Uygulama Aşamaları 404<br />
21.3.1. Deney Tasarımı 404<br />
21.3.2. Primer <strong>ve</strong> Prob Tasarımları 405<br />
21.4. qPCR’de Kullanılan Aletler 406<br />
21.5. Miktar Belirleme (Kantitasyon) 407<br />
21.5.1. Mutlak Miktar Belirleme 409<br />
21.5.2. Oransal Miktar Belirleme 410<br />
21.6. Gen Anlatımı Profillemesi 410<br />
21.7. Normalizasyon 411<br />
21.8. Laboratuvar Koşulları <strong>ve</strong> Kalite Kontrolü 412<br />
21.A. Gerçek Zamanlı PCR ile Maternal Kanda Fetal RhD Geninin<br />
Tanımlanması 423<br />
Tuba GÜNEL<br />
21.B. Schizosaccharomyces pombe’de aft1 Geninin Göreceli Anlatım Analizi 425<br />
Bedia PALABIYIK<br />
21.C. Sybr Green I Boya <strong>Temel</strong>li Gerçek Zamanlı PCR ile<br />
Fusarium graminearum tri5 Geninin Anlatım Analizi 429<br />
Emre YÖRÜK, Gülruh ALBAYRAK<br />
21.D.<br />
HeLa Hücre Kültüründe Oksidatif Stres ile Oluşturulan<br />
DNA Hasarının qPCR ile Belirlenmesi 435<br />
Özlem EROL TINAZTEPE
İçindekiler<br />
xi<br />
22. Mikrodizilim Teknolojisi 441<br />
Ayşegül TOPAL SARIKAYA, Tuba GÜNEL<br />
22.1. DNA Mikrodizilimleri 441<br />
22.2. Protein Mikrodizilimleri 445<br />
22.3. DNA Mikroçipi Üretimi 447<br />
22.3.1. Robotik Baskılama 448<br />
22.3.2. Oligonükleotid Mikrodizilim Problarının in situ Sentezle Hazırlanması 449<br />
22.A. Serbest Fetal DNA’da Trizomi21 Tanısı için aCGH 455<br />
Tuba GÜNEL<br />
23. Genetik Çeşitlilik (Varyasyon) <strong>Analizler</strong>i 459<br />
Nermin GÖZÜKIRMIZI<br />
23.1. Genetik Çeşitlilik (Varyasyon) Mekanizmaları 459<br />
23.2. Genetik Çeşitlilik (Varyasyon) Analiz Tipleri 460<br />
24. Epigenetik <strong>Analizler</strong> 465<br />
Nermin GÖZÜKIRMIZI<br />
24.1. DNA Değişimleri 465<br />
24.2. Kromatin Değişimleri 467<br />
24.3. Transkripsiyon Sonrası Değişimler 467<br />
24.4. Özel Epigenetik Örnekler 467<br />
24.5. Epigenetik Yeniden Programlama 467<br />
24.6. Epigenomik 468<br />
24.7. Epigenetik Değişimlerle Çalışma <strong>Yöntemleri</strong> 468<br />
PROTEİNLERİN İZOLASYON <strong>ve</strong> ANALİZİ 473<br />
25. Proteinlerin İzolasyonu 475<br />
Nazlı ARDA, Haluk ERTAN<br />
25.1. Alet, Malzeme <strong>ve</strong> Kimyasal Maddeler 475<br />
25.2. Protein Ekstresinin (Özütünün) Hazırlanması 477<br />
25.2.1. <strong>Biyoloji</strong>k Materyaller 477<br />
25.2.2. Protein Ekstraksiyonu 478<br />
25.2.3. Saklama Koşulları 480<br />
25.3. Suda Çözünen Proteinlerin Ekstraksiyonuna Örnekler 480<br />
25.3.1. Memeli Dokularından Ekstraksiyon 480<br />
25.3.2. Eritrositlerden Ekstraksiyon 481<br />
25.3.3. Yumuşak Bitkisel Dokulardan Ekstraksiyon 481<br />
25.3.4. Mayalardan Ekstraksiyon 482<br />
25.3.5. Bakterilerden Ekstraksiyon 482<br />
25.3.6. Yağlı Dokulardan Ekstraksiyon 483<br />
25.4. Zar (Membran) Proteinlerinin Ekstraksiyonu 483<br />
25.5. Protein Derişiminin Artırılması 485<br />
25.5.1. Kuru Polimer Kullanımı 486<br />
25.5.2. Ultrafiltrasyon 486<br />
25.5.3. Diyaliz 486<br />
25.5.4. Liyofilizasyon 488<br />
25.5.5. Çöktürme 489
xii<br />
İçindekiler<br />
25.A. Protein A <strong>ve</strong>ya Protein G Bağlı Sefaroz Boncuklarla İmmün Çöktürme 495<br />
Cenk KIĞ<br />
26. Proteinlerin Nicel Analizi 503<br />
Nazlı ARDA, Haluk ERTAN<br />
26.1. A 280<br />
/A 260<br />
Oranının Belirlenmesi (Warburg-Christian Yöntemi) 503<br />
26.2. Biüret Yöntemi 504<br />
26.3. Boya-Bağlama (Bradford) Yöntemi 505<br />
26.4. Lowry Yöntemi 506<br />
26.5. Bisinkoninik Asit (BCA) Yöntemi 507<br />
27. ELISA 513<br />
Ali KARAGÖZ<br />
27.1. Doğrudan ELISA 515<br />
27.2. Dolaylı ELISA 515<br />
27.3. Sandviç ELISA 516<br />
27.4. Yarışmalı ELISA 516<br />
27.5. ELISA Kaplarının Seçimi <strong>ve</strong> Kaplanması 517<br />
27.6. ELISA Yöntemini Etkileyen Faktörler 517<br />
27.7. ELISA Sonuçlarının Değerlendirilmesi 517<br />
28. Tek Boyutlu Protein Elektroforezi <strong>ve</strong> Protein Saptama <strong>Yöntemleri</strong> 523<br />
Nazlı ARDA, Evren ÖNAY UÇAR, Haluk ERTAN<br />
28.1. Doğal Jel Elektroforezi 528<br />
28.2. Doğal Olmayan (Denatüre) Jel Elektroforezi (SDS-PAGE) 532<br />
28.3. Düşük Molekül Ağırlıklı Polipeptidlerin Elektroforezi 537<br />
28.4. Protein Saptama <strong>Yöntemleri</strong> 539<br />
28.4.1. Jel Boyama <strong>ve</strong> Molekül Ağırlığının Belirlenmesi 539<br />
28.4.2. Membrana Aktarım <strong>ve</strong> Western Damgalama (“Blotting”) 545<br />
28.5. Tek Boyutlu Elektroforezde <strong>ve</strong> Western Damgalamada Karşılaşılan<br />
Sorunlar <strong>ve</strong> Çözüm Önerileri 565<br />
28.5.1. Doğal <strong>ve</strong> Denatüre PAGE’de Karşılaşılan Sorunlar . . . . . . . . . . . . . . . . . 565<br />
28.5.2. Membrana Aktarım <strong>ve</strong> Western Damgalamada Karşılaşılan Sorunlar 568<br />
29. Proteinlerin Kromatografik Ayrımı <strong>ve</strong> Saflaştırılması 571<br />
Nazlı ARDA, Haluk ERTAN<br />
29.1. Jel Geçirgenlik Kromatografisi 573<br />
29.2. İyon Değişimi Kromatografisi 575<br />
29.3. Metal Kelat Kromatografisi 579<br />
29.4. Tiyofilik Adsorpsiyon Kromatografisi 581<br />
29.5. Hidrofobik Etkileşim Kromatografisi <strong>ve</strong> Ters Faz Kromatografi 581<br />
29.6. Yalancı Afinite (Psödoafinite) Kromatografisi 582<br />
29.6.1. Boya Ligand Kromatografisi 582<br />
29.7. Afinite (İlgi) Kromatografisi 583<br />
29.7.1. Rekombinant Proteinlerin Afinite Kromatografisiyle Saflaştırılması 586<br />
29.7.2. Lektin Afinite Kromatografisi 587<br />
29.8. Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi (HPLC) 588<br />
29.9. Kristallendirme <strong>ve</strong> Saflık Kontrolü 589
İçindekiler<br />
xiii<br />
30. Enzimatik Analiz <strong>ve</strong> Aktivite Belirleme <strong>Yöntemleri</strong> 591<br />
Haluk ERTAN, Nazlı ARDA<br />
30.1. Enzimatik Analizin <strong>Temel</strong> İlkeleri . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 591<br />
30.1.1. Başlangıç Hızının Tanımlanması 592<br />
30.1.2. Başlangıç Hızına İlişkin Sapmalar 593<br />
30.2. Enzim Aktivitesinin Tanımlanması <strong>ve</strong> Ölçülmesi 595<br />
30.2.1. Aktivite Ölçüm Koşulları 596<br />
30.2.2. Aktivite Ölçümlerinde Dikkat Edilmesi Gereken Noktalar 596<br />
30.2.3. Enzim Aktivitesinin Hesaplanması: Birimler <strong>ve</strong> Spesifik Aktivite Absorpsiyon<br />
(Ekstinksiyon) Katsayısı 596<br />
30.3. Enzimlerle İlgili Deneysel Bilgiler 598<br />
30.3.1. Doğrudan <strong>ve</strong> Devamlı Ölçüm 598<br />
30.3.2. Dolaylı Ölçüm 599<br />
30.4. Enzim Aktivitesinin Jel Üzerinde Gösterilmesi 602<br />
30.5. Enzim Kinetiği 603<br />
30.5.1. Enzim Kinetiğinin <strong>Temel</strong> Bağıntıları 603<br />
30.5.2. Kinetik Değerlerin Saptanması İçin Enzim Aktivite Ölçümleri 606<br />
30.5.3. Somut Değerlere Dayalı Kinetik Çalışma Örneği 609<br />
31. Oksidatif Protein Hasarlarının Belirlenmesi 611<br />
Nazlı ARDA, Murat PEKMEZ<br />
31.A.<br />
Hidrojen Peroksit Uygulanmış Maya Hücrelerinde<br />
Protein Karbonillerinin Belirlenmesi 617<br />
Murat PEKMEZ<br />
32. Protein-Protein Etkileşiminin Belirlenmesi (Maya İkili Melez Sistemi) 621<br />
Filiz GÜREL<br />
32.1. İkili Melez Sisteminin <strong>Temel</strong>i 621<br />
32.2. Maya İkili-Melez Sisteminde Kullanılan Vektörler 622<br />
32.3. cDNA Kitaplıkları 623<br />
32.4. Raportör Genler 623<br />
32.5. Maya İkili Melez Sisteminin Aşamaları 624<br />
32.6. Yöntemin Üstünlükleri <strong>ve</strong> Zorlukları 625<br />
32.7. Maya İkili Melez Sisteminin Uygulandığı Alanlar 626<br />
33. İzotermal Titrasyon Kalorimetresi 635<br />
Haluk ERTAN<br />
33.1. İTC <strong>ve</strong> Bağlanma Termodinamiği 636<br />
33.2. İTC <strong>ve</strong> Enzim Kinetiği 638<br />
33.3. MicroCal iTC 200<br />
Sistemi 638
xiv<br />
İçindekiler<br />
PROTEOMİK ANALİZLER 647<br />
34. İki Boyutlu Protein Elektroforezi 649<br />
Nazlı ARDA, Evren ÖNAY UÇAR, Haluk ERTAN<br />
34.1. Birinci Boyut: İzoelektrik Odaklama (IEF) 649<br />
34.1.1. Dikey Sistemlerde Hazırlanan Jellerle IEF 649<br />
34.1.2. Yatay Sistemde <strong>ve</strong> Hazır Şeritlerle IEF 655<br />
34.2. İkinci Boyut: SDS-PAGE 660<br />
34.3. Sonuçların Değerlendirilmesi 662<br />
34.4. İki Boyutlu Elektroforez Sürecinde Karşılaşılan Sorunlar <strong>ve</strong> Çözüm Önerileri 663<br />
34.A.<br />
C6 Sıçan Glioma Hücrelerindeki Stres Proteinlerinin<br />
<strong>Proteomik</strong> Analizi 667<br />
Evren ÖNAY UÇAR<br />
35. İki Boyutlu DIGE 675<br />
Murat KASAP, Gürler AKPINAR<br />
35.1. DIGE Yönteminin <strong>Temel</strong>i 676<br />
35.2. DIGE Deneyinin Tasarlanması 677<br />
35.3. Protein Örneklerin DIGE için Hazırlanması 678<br />
35.4. Minimal DIGE Yönteminin Uygulanması 679<br />
36. Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometrisi (LC-MS) Proteomiği 687<br />
Volkan YILDIRIM, Gülay ÖZCENGİZ<br />
36.1. LC-MS’de Kullanılan Sıvı Kromatografi Aletleri 687<br />
36.2. Kütle Spektrometrisi 687<br />
36.2.1. LC-MS’de Kullanılan İyonizasyon Kaynağı: Elektro Sprey İyonizasyonu (ESI) 688<br />
36.2.2. LC-MS’de Kullanılan Analizörler 688<br />
36.3. LC-MS ile Nicel (Kantitatif ) <strong>Proteomik</strong> 692<br />
BİYOENFORMATİK 701<br />
37. Genom <strong>ve</strong> Proteom Analizinde Biyoenformatik 703<br />
Ercan ARICAN<br />
37.1. <strong>Biyoloji</strong>k Veri Tabanları 703<br />
37.2. Farklı Veri Tabanı Türleri 704<br />
37.3. Tanımlayıcılar <strong>ve</strong> Giriş Şifreleri 705<br />
37.4. Nükleotid Dizi Veri Tabanları 705<br />
37.4.1. Birincil Nükleotid Dizi Veri Tabanları 705<br />
37.5. Protein Dizi Veri Tabanları 706<br />
37.6. Dizi Motif Veri Tabanları 707<br />
37.7. Makromoleküler Üç Boyutlu Yapı Veri Tabanları 708<br />
37.8. Diğer Veri Tabanları 709<br />
37.9. Tarama, İndeksleme <strong>ve</strong> Çapraz Referanslama Sistemleri 709<br />
37.A.<br />
Mayada (Saccharomyces cerevisiae) Süperoksit Dismutaz (SOD)<br />
Enziminin BLAST Analizi 717<br />
Çağatay TARHAN
İçindekiler<br />
xv<br />
EKLER<br />
Ek 1 <strong>Moleküler</strong> <strong>Biyoloji</strong> Laboratuvarlarında Bulunması Gereken Çeşitli Aletler 721<br />
Ek 2 Bilimsel Sembol Olarak Kullanılan Yunan Alfabesi Harfleri 722<br />
Ek 3 Standart Önekler 722<br />
Ek 4 Dönüşüm Faktörleri 723<br />
Ek 5 Önemli Değişmezler 723<br />
Ek 6 <strong>Biyoloji</strong>k Makromoleküllerle İlgili Bazı Dönüşümler 723<br />
Ek 7 Derişik Asit <strong>ve</strong> Bazlarla İlgili Bazı Değerler 724<br />
Ek 8 Çeşitli Stok Çözeltilerin Yaklaşık pH Değerleri 724<br />
Ek 9 Bazı Tamponların Çalışma Aralığı 725<br />
Ek 10 Çeşitli Tampon Bileşenlerinin 25°C’daki pKa Değerleri 726<br />
Ek 11 Çeşitli Tamponlar <strong>ve</strong> Hazırlanışları 727<br />
Ek 12<br />
<strong>Moleküler</strong> <strong>Biyoloji</strong>k Çalışmalarda Ortamda Bulunması İstenmeyen<br />
Bazı Metalleri Bağlayan Kelatörlerin Kararlılık Değişmezleri 736<br />
Ek 13 <strong>Moleküler</strong> <strong>Biyoloji</strong>k Çalışmalarda Çok Kullanılan Tiyol Bileşikleri 737<br />
Ek 14 Nükleik Asitlerin <strong>ve</strong> Proteinlerin Denatürasyonuna Yol Açan Maddeler 737<br />
Ek 15 <strong>Moleküler</strong> <strong>Biyoloji</strong>de En Çok Kullanılan Filtre Kağıtları 738<br />
Ek 16 Millipore® Filtrelerde Por Çapına Göre Geçebilecek Partikül Büyüklükleri 738<br />
Ek 17 Damgalama (“Blotting”) Filtreleri 739<br />
Ek 18 Santrifüj Rotorlarının Etkinlikleri 739<br />
Ek 19 Santrifüj Tüpü Malzemelerinin Özellikleri 740<br />
Ek 20 Çeşitli Hücre Kısımları İçin Uygun Santrifüjleme Koşulları 740<br />
Ek 21<br />
Çeşitli Partiküllerin İzopiknik Ayrımları İçin Uygun Yoğunluk<br />
Derecelenmesi Ortamları 741<br />
Ek 22 Peptid <strong>ve</strong> Proteinlerin Ters-Faz HPLC Koşulları <strong>ve</strong> Kolon Özellikleri 741<br />
Ek 23 Proteinlerin Ayrılmasında Kullanılan İyon Değiştirici Matriksler 742<br />
Ek 24 İyon Değişimi Kromatografisinde Kullanılan Bazı Tamponlar 742<br />
Ek 25<br />
Jel Filtrasyonunda Kullanılan Çeşitli Kolon Dolgu Maddelerinin<br />
Proteinleri Ayırma Sınırı 743<br />
Ek 26 Elektromanyetik Spektrum <strong>ve</strong> Spektroskopik Çalışma Alanları 744<br />
Ek 27 Radyoaktivite ile İlgili Birimler <strong>ve</strong> Dönüşüm Faktörleri 744<br />
Ek 28 Araştırmalarda Kullanılan Radyoizotopların Bazı Özellikleri 745<br />
Ek 29 Nükleik Asitlerin Yapısal Bileşenlerinin Bazı Fizokokimyasal Özellikleri 746<br />
Ek 30 Bazı Restriksiyon Endonükleazlarının DNA’ da Tanıma Dizileri <strong>ve</strong><br />
Kesme Noktaları 747<br />
Ek 31 Bazı Organizmaların Kromozom Sayıları <strong>ve</strong> Genom Bilgileri 748<br />
Ek 32 Genetik Şifre 749<br />
Ek 33 Proteinlerin Yapısında Bulunan α-Amino Asitlerin Yapısal Formülleri <strong>ve</strong><br />
Bazı Fizikokimyasal Özellikleri 750<br />
Ek 34 BCA Yöntemiyle Uyumlu Maddeler <strong>ve</strong> Derişimleri 752<br />
Ek 35 Mini-PROTEAN Tetra Cell (Bio-Rad) Düzeneği <strong>ve</strong> Kurulumu 754<br />
Ek 36 Bazı Ticari Afinite Matriksleri 759<br />
Ek 37 Afinite Kromatografisinde Kullanılan Bazı Ligandlar <strong>ve</strong> Özgüllükleri 759<br />
Ek 38 Glikoproteinlerin Saflaştırılmasında Kullanılan Bazı Lektinler 760<br />
Ek 39 2-DE Rehidrasyon Tamponları 761<br />
Ek 40<br />
Proteinlerde Belli Amino Asitlerde Kesme Yapan Bazı Enzim <strong>ve</strong><br />
Kimyasal Maddeler . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 761<br />
DİZİN 763
1<br />
<strong>Moleküler</strong> <strong>Biyoloji</strong>de Kullanılan<br />
Yöntemlere Genel Bakış<br />
• • • •<br />
Güler TEMİZKAN<br />
Canlı organizmalar yaşamları boyunca kendini idare edebilen <strong>ve</strong> çoğaltabilen kimyasal sistemlerdir. Viroidler, virüsler<br />
gibi bazı ayrıcalıklı gruplar dışında, tüm canlılar kimyasal maddelerin yoğun çözeltileriyle dolu <strong>ve</strong> küçük birimler olan<br />
hücrelerden oluşur. Buna göre, canlılık olayları hücreler içerisindeki biyolojik moleküllerin yapı <strong>ve</strong> işlevlerine bağlı<br />
olarak ortaya çıkar.<br />
İnorganik <strong>ve</strong> organik kimyasal bileşenlerden oluşan hücrelerde, karbon atomlarından türevlenen organik bileşikler<br />
yaşam molekülleri olarak kabul edilirler. Bir hücrenin ağırlığının yaklaşık %99’u sadece dört çeşit elementle (C, H,<br />
N <strong>ve</strong> O) sınırlıdır. Hücreyi oluşturan temel organik moleküller başlıca iki grupta toplanabilir: küçük moleküller<br />
hücrenin temel kimyasal yapı taşlarının sentezinde <strong>ve</strong> enerji elde edilmesinde kullanılırlar; küçük moleküllerin<br />
polimerleri olan büyük moleküller (makromoleküller) ise biyolojik süreçlerin özgüllüğünden <strong>ve</strong> biyolojik bilginin<br />
transferinden sorumludurlar. Polimerik yapıdaki büyük moleküller monomerik yapıdaki küçük moleküllerin kovalent<br />
olarak birbirlerine bağlanarak tekrarlanmasıyla oluşurlar.<br />
Küçük organik moleküllerin ağırlıkları 100-1000 arasında değişir <strong>ve</strong> 30 ya da daha fazla C atomu içerirler. Bunlar<br />
genellikle çözelti içerisinde serbest durumda bulunurlar <strong>ve</strong> bir kısmı daha sonra makromoleküllerin meydana<br />
geleceği bir ürün havuzu oluştururlar. Küçük moleküller aynı zamanda, besin kaynaklarından türevlenen enerjiyi<br />
hücre tarafından kullanılabilecek biçime dönüştüren kimyasal reaksiyonların da temel aracılarıdır. Küçük moleküllerin<br />
miktarı hücredeki toplam organik maddenin yaklaşık onda birini oluşturur <strong>ve</strong> aşağı yukarı bin kadar farklı çeşidi<br />
bulunur. Küçük moleküllerden sentez edilen tüm biyolojik makromoleküller yıkıldıklarında aynı basit moleküllere<br />
dönüşürler. Hücrelerde küçük organik moleküllere ait başlıca dört temel aile vardır: basit şekerler, yağ asitleri,<br />
amino asitler <strong>ve</strong> nükleotidler. Bu ailelerin hepsi ortak kimyasal özellikleri olan çok farklı üyeleri içerirler.<br />
Bir makromolekül küçük molekül ağırlıklı alt birimlerin birbirine eklenmesiyle meydana gelen uzun <strong>ve</strong> zincir<br />
biçiminde polimerdir. Makromoleküller (proteinler, nükleik asitler <strong>ve</strong> polisakkaridler) küçük moleküllerin<br />
(amino asitler, nükleotidler <strong>ve</strong> şekerler) sınırlı bir repertuvarından meydana gelmekle birlikte ilginç özelliklere<br />
sahiptirler <strong>ve</strong> kendilerini oluşturan basit yapılı kimyasal öncülleriyle aralarında çok az benzerlik vardır. Lipitler<br />
ise, bazı özellikleri açısından makromoleküllere benzemekle birlikte (örneğin, çoğunun daha küçük moleküllerin<br />
polimerleri olarak sentez edilmeleri <strong>ve</strong> daha büyük yapılar halinde bir araya gelmeleri gibi) genellikle bu molekül<br />
grubu içerisine sokulmazlar. Bir makromolekülün üç boyutlu yapısı <strong>ve</strong> sonuçta işlevi için alt birimlerin kesin dizisi<br />
çok önemli olduğundan, polimerlerin biyosentezleri zincirin her konumuna doğru alt birimin girmesini sağlayacak<br />
mekanizmaları gerektirir. Makromoleküllerin her biri özel bilgileri taşırlar. Yapılarındaki biyolojik mesajlar, onların<br />
işlevlerini kusursuz biçimde yapmalarını sağlamak üzere, diğer moleküllerle yaptığı etkileşimlerde ortaya çıkar.<br />
Canlılık olaylarının karmaşıklığı, bu olaylara katılan moleküllerin çoğunun çok büyük boyutta olmalarını gerektirir.<br />
Makromoleküllerin ağırlıkları yaklaşık 10.000-1.000.000 arasında değişir. Küçük bir molekül olan su hücrenin toplam<br />
kitlesinin %70’ini kapsar; geri kalan kısmının hemen tamamı da makromoleküllerden ibarettir (Tablo 1.1).<br />
1
NÜKLEİK ASİTLERİN<br />
İZOLASYON <strong>ve</strong> ANALİZİ
2<br />
Güncel Organizmalardan<br />
DNA İzolasyonu<br />
• • • •<br />
Ayşegül TOPAL SARIKAYA<br />
Doğadaki canlıların tümüne yakın kısmında kalıtsal molekül DNA’dır. Sadece bazı virüsler ile viroidlerde bu görevi<br />
RNA yüklenir. Bu nedenle, genetik olayların hücrede moleküler düzeydeki temeli kalıtsal molekül görevini yüklenen<br />
nükleik asitlerin yapı <strong>ve</strong> özelliklerine dayanır. Nükleik asitlerin iki türü (DNA <strong>ve</strong> RNA) nükleotidlerin polimeridir. Bir<br />
nükleotid üç kısımdan oluşur: (1) Heterosiklik halka yapısı gösteren 5 karbonlu bir şeker (pentoz). (2) Heterosiklik<br />
bir C halkası <strong>ve</strong> N atomları içeren organik bir baz (pürin <strong>ve</strong>ya pirimidin). (3) Bir fosfat grubu. Nükleotid yapısında,<br />
bir glikozidik bağla birbirine bağlanmış baz <strong>ve</strong> pentoz kısmına nükleozid adı <strong>ve</strong>rilir. Nükleotidler birbirlerine bir<br />
nükleotidin pentozunun 5’ konumundaki fosfat (PO 4<br />
) grubu ile onu izleyen nükleotidin pentozunun 3’ konumundaki<br />
hidroksil (OH) grubu arasında kovalent şekilde oluşan fosfodiester bağı ile bağlanır. Canlıların büyük çoğunluğunda<br />
çift iplikli olan DNA molekülünde iki polinükleotid iplik bazları arasında oluşan hidrojen bağlarıyla birarada tutulur<br />
<strong>ve</strong> iki iplik birbirine zıt yönde paraleldir (Şekil 2.1).<br />
Hidrojen bağı<br />
Glikozidik<br />
bağ<br />
Fosfodiester<br />
bağı<br />
Küçük oluk<br />
Büyük oluk<br />
Küçük oluk<br />
Büyük oluk<br />
Şeker-fosfat<br />
omurgası<br />
Şekil 2.1. Çift iplikli (ikili sarmal) DNA’nın yapısı.<br />
71
3<br />
Fosillerden DNA İzolasyonu<br />
• • • •<br />
Ercan ARICAN<br />
3.1. Fosiller <strong>ve</strong> Antik DNA<br />
Fosiller, geçmişe ışık tutan biyolojik materyallerdir. Fosil terimi (Latince fossilum, kazılıp çıkartılan nesne) sadece<br />
saklanmış kemik, kabuk, diş, bitki <strong>ve</strong>ya hayvanların sert kısımlarını değil daha önce yaşamış olan canlılara ait izleri<br />
belirtmek için de kullanılabilir. Canlılığın biyolojik <strong>ve</strong> kültürel tarihinin anlaşılmasında fosiller üzerinde yapılan<br />
çalışmalar önemli rol oynamaktadır. Uzun yıllar morfolojik, anatomik vb. yöntemlerle fosil çalışmaları sürdürülmüştür.<br />
Jeologların, doğa bilimcilerin, arkeologların, tarihçilerin çalışmaları sayesinde canlıların biyolojik <strong>ve</strong> kültürel evrimine<br />
dair fosil kayıtları bulunmuş, değerlendirilmiştir.<br />
Doğa tarihinin aydınlatılması için üç geleneksel yola başvurulabilir. Birincisi kemikleri, temrenleri, çömlek parçalarını,<br />
istiridye kabuklarını <strong>ve</strong> geçmişten bugüne sağlam kanıt olarak gelen diğer kalıntıları inceleyen arkeoloji bilimidir.<br />
İkincisi yol yenilenmiş kalıntıların, yani kendileri eski olmayan ama eski olanın bir kopyasını <strong>ve</strong>ya temsilini içeren ya da<br />
cisimleştiren kalıntıların incelenmesidir. Bu kalıntılar çeşitli şekillerde ikilenebilen yazılı <strong>ve</strong> sözlü anlatımla olabileceği<br />
gibi bizi asıl ilgilendiren DNA da olabilir. Üçüncü yol olan üçgenleme ise bir atanın, soyu tükenmemiş iki torununu<br />
karşılaştırarak belirlenmesidir.<br />
Ortak ataya ulaşmak için farklı canlılar arasındaki benzerliklere (özellikle DNA benzerliğine) bakılır. Evrimsel ölçekte<br />
çok uzak dahi olsalar, iki tür arasında DNA benzerliği süreç boyunca korunmuş dizilerden dolayı yüksek orandadır.<br />
Bu nedenle herhangi bir bakteri ile insan arasında dahi üçgenleme yapılabilir. Bu yöntem aynı zamanda linguistik<br />
(dilbilimsel) evrimde de kullanılır.<br />
Yirminci yüzyılda genetik biliminin gelişmesiyle birlikte biyolojik bilimlerin birçoğunda olduğu gibi fosil çalışmalarında<br />
da önemli bir dönüşüm gerçekleşmiştir. Laboratuvar olanaklarına bağlı olarak DNA temelli çalışmalara hızlı bir geçiş<br />
olmuştur. Özellikle 1980’li yıllardan itibaren moleküler yöntemler büyük önem kazanmıştır.<br />
Ölmüş organizmalardan <strong>ve</strong>ya eski kemik kalıntılarından elde edilen DNA kalıntıları antik (fosil) DNA olarak<br />
adlandırılır. İlk kez 1984’te Higuchi <strong>ve</strong> arkadaşları tarafından soyu tükenmiş bir zebra alt türü fosilinin DNA’sı, 1985’de<br />
de Pääbo tarafından Mısırlı bir bireye ait mumyanın DNA’sı bakteride klonlanmıştır. Ancak az miktarda <strong>ve</strong> kalitesiz<br />
olan DNA aynı dizileri içeren bakteriden izole edilememiştir. 1986 yılında Mullis <strong>ve</strong> arkadaşları tarafından, DNA’yı<br />
enzimatik olarak in vitro ortamda çoğaltmayı sağlayan polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yönteminin (bkz. Bölüm<br />
16) bulunmasıyla fosil DNA’lardan da çok sayıda kopya elde edilebilmiştir. Antik DNA’lar taksonomide, adli tıpta,<br />
soyu tükenmiş türlerin belirlenmesinde <strong>ve</strong> en çok da evrim çalışmalarında kullanılmaktadır. Örneğin, dünyada en<br />
iyi korunmuş örneklerden biri olan <strong>ve</strong> Ötzi adı <strong>ve</strong>rilen modern insan fosilinin midesinden alınan örneklerden DNA<br />
izolasyonu yöntemiyle son yediği yemeğe kadar saptama yapılabilmiştir.<br />
83
4<br />
Kriminal Örneklerden DNA<br />
İzolasyonu<br />
• • • •<br />
Ayşegül TOPAL SARIKAYA<br />
Günümüzde tükürük, deri parçası, kan, saç, kemik, idrar <strong>ve</strong> sperm gibi nükleuslu hücre içeren her türlü biyolojik<br />
kanıttan DNA profilleri elde edilebilmektedir. DNA profilleri populasyon içerisinde oldukça polimorfik olan kısa<br />
ardışık tekrarlara (“Short Tandem Repeats, STR) ait lokuslar kullanılarak çıkarılmaktadır. Elde edilen <strong>ve</strong>rilerle adli amaçlı<br />
kimlik saptanması, babalık tayini, akrabalık ilişkilerinin tayini, hırsızlık, öldürme <strong>ve</strong> ırza geçme gibi kriminal olayların<br />
aydınlatılması sağlanmaktadır. Olay yerinden alınan biyolojik materyalden bir DNA profili elde edildikten sonra<br />
bu profilin şüpheli bireyle uyuşup uyuşmadığının araştırılması için mağdurdan <strong>ve</strong> olayla ilgisi olduğu düşünülen<br />
şüpheliden örnek alınıp incelenmelidir. Dışlama durumunda; uyuşmayan iki DNA örneğinin, %100 olasılıkla aynı<br />
bireyden gelmediği kanaatine varılır (National Research Council, 1996). Dışlama görülmeyen durumlarda, olay<br />
yerinden elde edilen biyolojik örneğin bireye ait olma olasılığı hesaplanmalıdır. Herhangi bir genetik işaretin belli<br />
bir toplumda kullanım yararlılığının belirlenmesi <strong>ve</strong> bu işaretle ilgili olasılık hesaplamalarının yapılabilmesi için<br />
incelenen genetik işaretin o toplumda görülme sıklığının bilinmesi gerekmektedir. Bu amaçla suçun işlendiği<br />
bölgedeki toplumun genelini temsil eden <strong>ve</strong>ri tabanlarına ihtiyaç duyulur.<br />
İnsan genomunun yaklaşık %10’u ardışık tekrar eden dizilerden oluşmaktadır. Değişken sayıda ardışık tekrarlanan<br />
diziler (“Variable Number of Tandem Repeat”, VNTR) birçok allele sahiptir. Bu alleller lokus içerisinde bir restriksiyon<br />
bölgesinin bulunup bulunmamasına göre değil, birbirine komşu olan iki restriksiyon bölgesi içerisindeki ardışık<br />
tekrar dizilerinin sayısına bağlı olarak oluşmaktadır. VNTR’ler mikrosatellitler <strong>ve</strong> minisatellitler olmak üzere alt sınıflara<br />
ayrılırlar. Bazı kaynaklarda genomda tekrar eden diziler, VNTR’ler (minisatellitler <strong>ve</strong> mikrosatellitler) <strong>ve</strong> kısa ardışık<br />
tekrarlar (“Short Tandem Repeat, STR) şeklinde ayrılmaktadır.<br />
Adli çalışmalarda kullanılan PCR’ye (bkz. Bölüm 16) dayalı ilk uzunluk polimorfizmi minisatellitlerdir. Minisatellitler<br />
uzunlukları 15-70 baz çifti arasında değişen tekrar birimlerine sahiptir <strong>ve</strong> STR’ler gibi PCR ile çoğaltılabilirler (Donnis-<br />
Keller <strong>ve</strong> ark., Nakamura <strong>ve</strong> ark.). STR lokusları ya da mikrosatellitler uzunlukları 2-7 baz çifti arasında değişen nükleotid<br />
dizilerinin ard arda tekrarlanmasıyla oluşur. STR lokusları insan genomu içinde yaygın olarak ortalama her 5-6 kb’de<br />
bir bulunur. Her lokus içerisindeki tekrar birimlerinin sayısının değişken olması, insan populasyonu içerisinde yüksek<br />
düzeyde bir polimorfizme neden olmaktadır. Bu nedenle STR lokusları çok değerli genetik işaretlerdir. STR’ler bağlantı<br />
haritalarının oluşturulmasında, hastalık genlerinin belirlenmesinde, adli olaylarda kimlik tespiti çalışmalarında,<br />
babalık testlerinde, insan kalıntıları <strong>ve</strong> antropolojik örneklerin incelenmesinde kullanılmaktadır.<br />
Uygulamalar sırasında, genom üzerinde çoğaltılması hedeflenen her bir STR bölgesi için gerekli primer setleri aynı<br />
reaksiyon tüpüne eklenmelidir. Çoklu sistemlerin yüksek ayrım gücüne, kolay <strong>ve</strong> gü<strong>ve</strong>nilir şekilde tanımlanabilme<br />
rahatlığına sahip olması gerekmektedir. Çoklu PCR (bkz. 16.5.7) sonucu elde edilen ürünlerin değerlendirilmesinde<br />
DNA kanıtını bırakan bireyin hangi alt populasyondan geldiği biliniyorsa hesaplama yapılırken bu alt populasyona<br />
ait <strong>ve</strong>ri tabanı da kullanılmalıdır.<br />
87
5<br />
Maternal Kandan Hücre Dışı Serbest<br />
Fetal DNA İzolasyonu<br />
• • • •<br />
Tuba GÜNEL<br />
Girişimsel olmayan (“non-invasi<strong>ve</strong>”) prenatal tanı (NIPT) gebeliğin her aşamasında uygulanabilen, gebelik kaybı<br />
riski olmayan doğum öncesi tanı yöntemlerinden biridir. Tanısal gü<strong>ve</strong>nilirliğinin bazı genetik hastalıklarda girişimsel<br />
yöntemlerle koyulan tanılar düzeyinde olması, bazı kromozom anomalilerinin tanısında ise %100’e yakın olması <strong>ve</strong><br />
fetal fizyolojiyi girişimsel olmayan şekilde araştırma olanağı sağlaması gelecek için büyük umutlar doğmasına neden<br />
olmuştur. NIPT’de ilk <strong>ve</strong> en önemli nokta fetal nükleik asitlerin izolasyonu aşamasıdır. 1997 yılında Lo <strong>ve</strong> arkadaşlarının<br />
maternal serumda serbest fetal DNA (cff DNA)’yı izole etmeleri NIPT için bir altın anahtar niteliğindedir. Serbest fetal<br />
DNA’nın izolasyonundan sonra genom, transkriptom <strong>ve</strong> proteom işlevlerinin her aşamasını gen anlatımı, gen miktarı<br />
<strong>ve</strong> gen dizilerinin analiziyle anlaşılır kılan çok sayıda yöntem geliştirilmiştir.<br />
Uygulama Örneği<br />
Materyal<br />
9.-11. gebelik haftaları arasındaki gebeden alınan 5 ml <strong>ve</strong>nöz kan örneğinden elde edilen kan plazması<br />
Kimyasal Malzemeler<br />
QIAmp DSP Virüs kiti<br />
_ Serbest fetal DNA’nın boyu kısa (25-300 nükleotid) olduğu için bu kit tercih edilmektedir.<br />
Kitin içeriği:<br />
Proteaz<br />
Lizis tamponu (AL)<br />
Etanol<br />
Yıkama tamponu 1 (AW1)<br />
Yıkama tamponu 2(AW2)<br />
Elüsyon tamponu<br />
İzolasyondan önce yapılan işlemler<br />
1. Kan örneği 2,700xg’de, 10 dakika santrifüjlenerek plazma kısmı hücrelerden ayrılır.<br />
2. Plazmanın hücre parçalarından ayrılması için, örnek 18.000xg’de 45 dakika santrifüjlenir.<br />
_ Hücre dışı serbest fetal DNA izolasyonunda en önemli aşama gebeden EDTA’lı tüpe alınan kanın plazmasının iki<br />
saat içerisinde ayrılmasıdır. DNA izolasyonu ayrılan plazmadan yapılmaktadır<br />
_ Hücrelerden <strong>ve</strong> parçalardan ayrılan plazma -70 C°’da stok halinde bekletilir.<br />
91
6<br />
DNA Replikasyon Kinetiği Analizi<br />
• • • •<br />
Cenk KIĞ<br />
Bölünen hücrelerin canlılıklarını sürdürebilmeleri için genetik bilginin yeni (yavru) hücrelere hatasız biçimde<br />
aktarılması gereklidir. Ayrıca, DNA molekülünün replikasyonu sırasında meydana gelen hataların çeşitli kalıtsal<br />
hastalıklara <strong>ve</strong> kanserleşmeye de neden olabildiği bilinmektedir. Bu tip hataların önlenmesi, kontrol <strong>ve</strong> onarım<br />
mekanizmalarının yanında replikasyon çatalının devamlılığının sağlanması (stabilitesi), çatalın optimal bir hızda<br />
ilerlemesi, başlangıç noktalarında (orijin) replikasyonun düzenli bir şekilde başlaması <strong>ve</strong> ilerlemenin başlangıç<br />
noktasına göre zıt yönde eş zamanlı <strong>ve</strong> simetrik bir şekilde meydana gelmesi gibi çeşitli faktörlerin (replikasyon<br />
dinamiği <strong>ve</strong>ya kinetiği) de sürdürülebilirliğini gerektirir.<br />
DNA replikasyon kinetiğinin nicel analizi amacıyla kullanılan doğrudan yöntemlerin başında DNA moleküllerinin<br />
cam yüzeylere bağlanıp iplikçikler halinde gerilerek incelenmesi gelir (Herrick <strong>ve</strong> Bensimon, 1999). Bu yöntemle<br />
replikasyon birimleri DNA iplikçikleri halinde ayrı ayrı incelenebilmektedir. Son yıllarda, aktif replikasyon çatallarının<br />
hareket yönü <strong>ve</strong> hızı gibi çeşitli değişkenlerin doğrudan <strong>ve</strong> kantitatif analizine olanak <strong>ve</strong>ren floresans mikroskopisi<br />
(bkz. 1.2.13) temeline dayalı daha basit <strong>ve</strong> ekonomik bir yöntem Schwab <strong>ve</strong> Niedzwiedz (2011) tarafından uyarlanarak<br />
geliştirilmiştir. Yöntemin ilk aşamasında, halojen bağlı nükleotid analoglarının (CldU, IdU, BrdU vb.) besi ortamına<br />
eklenerek replikasyon geçiren hücrelerde in vivo yeni sentezlenen DNA molekülünün yapısına katılmalarına<br />
yol açılır (Şekil 6.1a <strong>ve</strong> b). Ardından, parçalanan hücrelerden serbest kalan DNA moleküllerinin bir lam üzerinde<br />
x dk. x dk. y dk.<br />
(a)<br />
(b)<br />
Şekil 6.1. Yeni sentezlenen DNA ipliğinin IdU <strong>ve</strong> CldU molekülleriyle işaretlenmesi (Schwab <strong>ve</strong> Niedzwiedz’den. URL:http://www.<br />
jo<strong>ve</strong>.oCm/video/3255 internet adresinden de sürece ilişkin animasyona ulaşılabilir). (a) Birincil işaretleme: Kültür ortamına eklenen IdU<br />
molekülünün belli bir süre (x dakika) yeni sentezlenen DNA ipliğinin yapısına katılması; İkincil işaretleme: Kültür ortamına (CldU’ya göre<br />
10 kat daha derişik biçimde <strong>ve</strong> kesintisiz olarak) eklenen IdU molekülünün yeni sentezlenen DNA ipliğinin yapısına katılması (kesintisiz<br />
<strong>ve</strong> eşit sürelerde inkübasyonun sağlanabilmesi için arada yıkama yapılmamalıdır), (b) özgül birincil antikorlarla CldU <strong>ve</strong> IdU işaretlemesi<br />
yapıldıktan sonra farklı renklerde floresan işaret taşıyan ikincil antikorlar (CldU için kırmızı <strong>ve</strong> IdU için yeşil) uygulanarak, konfokal<br />
mikroskopla bu moleküllerin yapıya katıldığı iplik kesintisiz olarak kırmızı <strong>ve</strong> yeşil bir çubuk şeklinde görüntülenebilir.<br />
93
7<br />
DNA Hasarları <strong>ve</strong> Tayin <strong>Yöntemleri</strong><br />
• • • •<br />
Melek ÖZTÜRK, Matem TUNÇDEMİR<br />
Hücre DNA’sı, hücre içi stresler, serbest oksijen radikalleri, UV, iyonize radyasyon (X-ışını) <strong>ve</strong> çeşitli mutasyon<br />
etmenleriyle fiziksel <strong>ve</strong>ya kimyasal değişimlere uğrar <strong>ve</strong> sonuçta DNA hasarları (baz değişimleri, nükleotid kayıpları<br />
<strong>ve</strong>ya kazanımları, tek ya da çift iplik kırıkları <strong>ve</strong>ya baz dimerleri) ortaya çıkar. DNA’daki bu değişimler, PCR (bkz. 15)<br />
Komet, TUNEL, HPLC-spektrofotometri (bkz. 1.2.7), FISH (bkz. Bölüm 13) <strong>ve</strong> akım sitometrisi gibi çeşitli yöntemlerle<br />
belirlenebilir.<br />
7.1. TUNEL Yöntemi<br />
DNA hasarlarının hücrenin onarım mekanizmaları tarafından düzeltilememesi durumunda hücre p53’ün kontrolü<br />
altında apoptotik ölüme (programlı hücre ölümü) gider. Apoptotik hücre ölümü embriyogenez, morfogenez,<br />
doku yenilenmesi <strong>ve</strong> hücresel bağışıklık gibi birçok fizyolojik süreçte rol oynar. Apoptoz hücre içinden <strong>ve</strong>/<strong>ve</strong>ya<br />
hücre dışından kaynaklanan birçok sinyalle tetiklenir. Hücre büzülmesi, hücre zarının tomurcuklanması, kromatin<br />
yoğunlaşması (kondensasyonu), DNA’nın nükleozomal bölgelerden kesilmesi <strong>ve</strong> nükleusun parçalara ayrılması<br />
apoptozun tipik morfolojik özellikleri olarak gözlenir. Apoptozun son aşamasında hücre küçük parçalara bölünür <strong>ve</strong><br />
zarla çevrili apoptotik cisimler ortaya çıkar. Bunlar, çoğunlukla makrofajlar <strong>ve</strong>ya komşu hücreler tarafından fagositozla<br />
ortadan kaldırılırlar <strong>ve</strong> bu nedenle apoptoz sonrası enflamasyon (yangı) oluşmaz. Apoptotik hücrede plazma<br />
zarının sitoplazmik yüzeyinde yer alan fosfatidilserinin dış yüzeye çıkması, Bcl-2 ailesinin proapoptotik üyelerinin<br />
aktifleşmesi <strong>ve</strong>ya antiapoptotik üyelerinin aktivitelerinin yok olmasıyla bozulan mitokondri zarı geçirgenliği<br />
(permeabilitesi) nedeniyle zarlar arasında yer alan bazı proteinlerin (örneğin sitokrom c, AIF, endonükleaz-G, Smac/<br />
diablo) sitoplazmaya kaçması, kaspazların aktifleşerek hücresel proteinleri parçalaması <strong>ve</strong> DNaz’ların kaspazlar<br />
tarafından aktifleştirilmesiyle DNA’nın parçalara ayrılması (fragmentasyonu) apoptozun belirteçleri olarak kabul<br />
edilir (Melino <strong>ve</strong> Vaux, 2010; Öztürk, 2009, 2011; Vanden Berghe <strong>ve</strong> ark., 2013).<br />
Apoptozun tayininde en belirgin gözlem nükleustadır. DNA ipliği, nükleozomlar arasındaki DNA bölgelerinden<br />
kaspaza bağımlı <strong>ve</strong>ya kaspazdan bağımsız yollarda endonükleazlar tarafından kesilir. 180 baz çifti <strong>ve</strong> katlarınca<br />
DNA parçaları ortaya çıkar. Kromatin yumağı şeklini kaybederek nükleusta belli bölgelerde yoğun heterokromatin<br />
yapıları şeklinde birikerek (kondensasyon) ışık <strong>ve</strong> elektron mikroskobunda piknotik nükleuslar olarak gözlemlenirler.<br />
DNA’nın oligonükleozomlar şeklinde kesilmesinin ardından nükleus parçalanır. Çoklu nükleus parçaları <strong>ve</strong> yoğun<br />
heterokromatin yapısındaki nükleuslar apoptozun tipik görüntülerini oluşturur <strong>ve</strong> apoptozun diğer hücre<br />
ölümlerinden ayrımlanmasında anahtar rol oynar (Kyrylkova <strong>ve</strong> ark., 2012; Matassov <strong>ve</strong> ark., 2004; Öztürk, 2009).<br />
Kromatin/DNA yoğunlaşması <strong>ve</strong> kırılmaları nükleusun parçalanmasından önce başlar. Erken dönemdeki<br />
kromatin yoğunlaşması ise DNA parçalanmasından önce gerçekleşir. Kromatin yoğunlaşmasında kaspaza<br />
bağımlı kinaz (“Mammalian sterile 20-like kinase1”, Mst1) aktifleşmesi gözlenir. Aktifleşen Mst1, nükleusa girer<br />
103
8<br />
Total RNA <strong>ve</strong> mRNA İzolasyonu<br />
• • • •<br />
Ayşegül TOPAL SARIKAYA<br />
Hücrelerdeki total RNA’nın bakterilerde toplam hücre ağırlığının %6’sını, gelişmiş yapılı canlılarda ise %1.1 kadarını<br />
kapsadığı bilinmektedir (bkz. Tablo 1.1). Örneğin, tipik bir memeli hücresi yaklaşık 10-15 µg total RNA içerir. Bu<br />
miktarın %80-85’i rRNA’ya (28S, 18S <strong>ve</strong> 5S rRNA) aittir. Kalan %15-20’lik miktar ise molekül ağırlığı düşük RNA türlerini<br />
(tRNA, nükleusa ait küçük RNA’lar) içermektedir. mRNA ise total RNA’nın %1-5’ni kapsayan, boyutları <strong>ve</strong> dizisi birkaç<br />
yüz bazdan birkaç kilo baza kadar değişen bir heterojenlik göstermektedir. Parçalanmamış <strong>ve</strong> temiz RNA izolasyonu,<br />
klonlama <strong>ve</strong> gen anlatımı analizi çalışmalarında oldukça önemli aşamalardan biridir. Herhangi bir hücre tipinden<br />
izole edilen total RNA’dan mRNA’nın izolasyonu <strong>ve</strong> bu işlemi takiben çift iplikli DNA (“complementary DNA”, cDNA)<br />
elde etmek de mümkündür. Böylece istenen dokudan cDNA kitaplığı oluşturulabilir <strong>ve</strong> istenen gen klonlanabilir<br />
(bkz. 15.15). Ayrıca, araştırılan genin transkripsiyon düzeyinde düzenlenme mekanizması incelenebilir.<br />
RNA çalışmalarının tümünde başlıca ön koşul yapısını koruyan parçalanmamış RNA’nın izolasyonudur. İzolasyon<br />
sırasında en fazla karşılaşılan sorun, aktivitesini uzun süre koruyan, ribonükleaz (RNaz) enziminin bulunuşudur.<br />
Çok az miktarlarda RNaz’ın varlığı bile RNA’nın bütün olarak elde edilmesini engelleyebilmektedir. Bu sorundan<br />
kurtulmak için tüm çözeltiler, cam <strong>ve</strong> plastik eşyalar özel yöntemlerle hazırlanmalı <strong>ve</strong> steril edilmelidir. RNaz<br />
özellikle çalışanın ellerinden bulaştığı için RNA izolasyonu sırasında kesinlikle eldi<strong>ve</strong>n giyilmelidir. Kirli cam eşya<br />
<strong>ve</strong>ya yüzeylerle temas edilmişse eldi<strong>ve</strong>nler değiştirilmelidir. İzolasyonda kullanılacak çözeltiler RNaz’ın aktivitesini<br />
yok eden dietilpirokarbonat (DEPC) ile hazırlanmalıdır. Bununla birlikte, Tris, DEPC’nin aktivitesini yok ettiği için Tris<br />
içeren çözeltiler DEPC ile hazırlanmamalıdır. Çözelti hazırlanmasında kullanılan tüm kimyasalları mümkünse sadece<br />
RNA çalışmalarına ayırmak en kesin yoldur. Tartımlarda daha önce elle tutulmuş spatül gibi araçların kimyasalların<br />
içine sokulması bile RNaz kirliliğine yol açacağından, bunların cam eşyalar gibi fırında steril edilmesi gerekir. Cam<br />
eşyalar 180°C’da 8 saat <strong>ve</strong>ya 300°C’da 4 saat tutularak, ya da kloroform ile yıkanarak RNaz’ın aktivitesinin yok edilmesi<br />
sağlanabilir. Bazı cam eşyalar, içinde %0.1 oranında çözünmüş DEPC bulunan su ile doldurularak 2 saat 37°C’da<br />
bekletilir. Daha sonra birkaç kez steril saf su ile yıkanır <strong>ve</strong> 15 dakika otoklavlanır. Bu işlem DEPC’nin uzaklaştırılması<br />
için gereklidir. Bu şekilde RNA’nın pürin bazlarının karbon atomlarının metillenmesi önlenir. Karboksimetillenme<br />
DNA/RNA <strong>ve</strong>ya RNA/RNA melezlerinin oluşumunu çok olumsuz etkilemez, fakat karboksimetillenmiş RNA düşük<br />
düzeyde anlatım yapar.<br />
Steril <strong>ve</strong> tek kullanımlık plastik eşyalar RNaz içermediklerinden RNA izolasyonu <strong>ve</strong> saklanması aşamalarında herhangi<br />
bir hazırlık gerektirmeden kullanılabilirler. Ancak bu malzemeleri de eldi<strong>ve</strong>nle tutmak gerekir. Elektroforez tanklarının<br />
da yukarıda açıklandığı gibi DEPC içeren suyla yıkanması önerilmektedir. Bununla beraber bazı araştırmacılar, DEPC<br />
ile işlem görmüş hiçbir malzemeye gerek olmadığını, RNaz aktivitesinin yok edilmesi için, DEPC yerine %30’luk H 2<br />
O 2<br />
ile yaklaşık 30 saniye yıkama <strong>ve</strong> birkaç kez saf su ile durulamadan sonra 180°C’da 6 saat tutmanın yeterli olacağını<br />
ileri sürmektedirler.<br />
RNA izolasyonu protokollerinin tümünde ilk aşama hücre çeperinin <strong>ve</strong> zarının parçalanmasıdır (lizis). Daha sonra<br />
hücre lizatının santrifüjlenmesi ile RNA diğer hücresel makromoleküllerden ayrılır. RNA izolasyonu yönteminin<br />
113
9<br />
siRNA <strong>ve</strong> miRNA İzolasyonu<br />
• • • •<br />
Tuba GÜNEL<br />
siRNA (“small interfering RNA”) ile miRNA (“micro RNA”) gen anlatımının kontrolünde rol oynayan düzenleyici RNA<br />
molekülleridir. Şifreleme yapmayan bu küçük RNA’lar biyokimyasal <strong>ve</strong> işlevsel olarak ayırt edilemediklerinden<br />
kökenlerine göre ayrılırlar (Şekil 9.1). miRNA’lar dsRNA (“double strand RNA”)’ların saç tokası şekilli öncüllerinden<br />
elde edilirken, siRNA’lar uzun dsRNA’lardan oluşur. Bu RNA’lar gelişim, farklılaşma, hücre çoğalması <strong>ve</strong> apoptoz gibi<br />
biyolojik süreçlerin düzenlenmesinde etkilidirler. miRNA’ların transkripsiyonu RNA polimeraz II tarafından yapılır.<br />
Birincil RNA kopyaları olan pri-mRNA 700 bç uzunluğundadır. Pri-miRNA’yı endonükleaz aktivitesiyle kesen RNAaz III<br />
ailesi üyesi enzim “Drosha” olarak adlandırır. “Drosha” pri-miRNA’yı keserek öncül miRNA (pre-miRNA)’ya dönüştürür.<br />
Pre-miRNA’lar 60-70 nükleotid uzunluğunda olup daha sonra nukleusun por kompleksini geçerek sitoplazmaya<br />
aktarılırlar. Bu aşamadan sonra miRNA <strong>ve</strong> siRNA aynı işlemlerden geçer. Sitoplazmada RNaz III enzim kompleksi<br />
aktivitesi olan “Dicer” tarafından tekrar kesilir <strong>ve</strong> 21-23 nükleotid uzunluğunda kısa RNA parçacıkları haline <strong>ve</strong>ya<br />
kısa RNA parçalarına dönüşürler. Dicer enzimi tarafından bu şekilde oluşturulan RNA’lar daha sonra çift iplikli RNA’ya<br />
bağlanan proteinlerin yardımıyla ATP’ye bağımlı bir biçimde tetiklenen susturum kompleksine (“RNA-induced<br />
silencing complex” RISC) aktarılırlar. RISC, RNA <strong>ve</strong> RNA bağlayan proteinlerce zengin bir komplekstir <strong>ve</strong> bu aşamada<br />
RISC’in substrat seçiciliğinden sorumlu olan argonot (“Argonaute”) proteinlerin çok önemli rol oynadığı bilinmektedir.<br />
Olgun siRNA <strong>ve</strong>ya miRNA ipliğinin mRNA ile etkileşimi de RISC içinde gerçekleşir. RISC yapısında bulunan substrat<br />
siRNA ise, hedef mRNA dizisiyle birebir eşleşir <strong>ve</strong> mRNA molekülü eşleşme bölgelerinden endonükleazlar tarafından<br />
kesilerek ortamdan uzaklaştırılır. Eğer RISC yapısında bulunan substrat miRNA ise, hedef mRNA’nın 3’-translasyonu<br />
yapılmayan bölgesindeki belirli nükleotidlerle (yani kısmen) eşleşebilmektedir.<br />
Uygulama Örneği<br />
Materyal<br />
Plasenta dokusu, kan serumu <strong>ve</strong> plazması<br />
Gerekli Malzemeler<br />
“RNAlater” (Ambion Life Technology, ABD)<br />
_ Elde edilen RNA’ları korumak <strong>ve</strong> kararlı durumda tutmak için kullanılır.<br />
RNA izolasyon Kiti (“miRVanaTM miRNA Isolation Kit”) (Ambion Life Technology, ABD)<br />
Lizis tamponu<br />
_ Hücreleri parçalamak için kullanılır.<br />
123
10<br />
Nükleik Asitlerin Analizi<br />
• • • •<br />
Ayşegül TOPAL SARIKAYA<br />
Nükleik asitlerin nanogram <strong>ve</strong>ya mikrogram düzeyindeki miktarlarının belirlenmesi, moleküler biyoloji alanında<br />
çalışan araştırıcılar için temel noktalardan biridir. Genellikle izole edilen kromozomal <strong>ve</strong>/<strong>ve</strong>ya kromozom dışı<br />
DNA’ların <strong>ve</strong> sitoplazmik <strong>ve</strong>ya organellere ait RNA’ların miktar tayininde absorbsiyon (soğurma) temeline<br />
dayanan spektrofotometrik yöntemler (bkz. 1.2.9) kullanılır. Nükleik asitlerin doğrudan görüntülenmesinde <strong>ve</strong>ya<br />
özgün dizilerde kesim yapan restriksiyon endonükleaz enzimlerinin etkisi sonucu oluşan farklı boyutlardaki DNA<br />
parçalarının saptanmasında ise elektroforetik yöntemlerden (bkz. 1.2.8) yararlanılır.<br />
10.1. Spektral Analiz<br />
Başlangıçta UV temelli olarak yapılan spektrofotometrik analizlere floresan boyaların kullanımıyla gerçekleştirilen<br />
floresansa dayalı spektroflorometrik analiz yöntemleri de eklenmiştir.<br />
10.1.1. UV-Spektrofotometrik Yöntem<br />
Nükleotidlerin heterosiklik halkaları 260 nm dalga boyunda maksimum absorbsiyon özelliği gösterir. Bu nedenle<br />
260 nm’de ölçülen absorbans değerleri (A 260<br />
) oldukça saf olarak izole edilen nükleik asitlerin mikrogram düzeyinde<br />
miktarlarının belirlenmesinde kullanılır.<br />
1 optik yoğunluk (OD) çift iplikli DNA için 50 µg/mL, tek iplikli DNA için 33 µg/mL, RNA için 40 µg/mL <strong>ve</strong><br />
oligonükleotidler için 20-30 µg/mL’ye karşılık gelmektedir. Buna göre nükleik asitler için miktar belirlenmesinde<br />
aşağıdaki formül kullanılır.<br />
DNA (RNA) (µg/mL) = A 260<br />
x sulandırım oranı x 50 (40)<br />
A 260<br />
’daki değerler DNA <strong>ve</strong> RNA’yı birbirinden tam olarak ayırt etmeye yetmez. Bununla beraber 260 <strong>ve</strong> 280 nm dalga<br />
boylarında okunan değerler arasındaki oran nükleik asitlerin saflığı hakkında bilgi <strong>ve</strong>rmektedir. Bunun yanı sıra<br />
proteinler de 280 nm’de absorbsiyon özelliği gösterirler, bu nedenle 280 nm de ölçülen bir değerdeki artış A 260<br />
/A 280<br />
oranında düşmeye neden olur. Saflaştırılmış DNA’da A 260<br />
/A 280<br />
oranı yaklaşık 1.75-1.8’in üzerinde olmalıdır. 325 nm’de<br />
ölçülen değer DNA çözeltisinde partikül bulunduğunu <strong>ve</strong>ya ölçümde kullanılan kü<strong>ve</strong>tin kirli olduğunu; 230 nm’deki<br />
değer ise nükleik asit çözeltisinde peptidlerin (özellikle aromatik halka taşıyanların) <strong>ve</strong>ya fenolün bulunduğunu<br />
gösterir. Ölçümlerde UV geçirgen kuvartz kü<strong>ve</strong>t kullanılmalıdır. Cam <strong>ve</strong>ya plastik kü<strong>ve</strong>tler kullanılamaz. Ayrıca tek<br />
iplikli DNA, RNA, PCR primerleri <strong>ve</strong> dNTP’ler ya da fenol gibi aromatik bileşikler kullanılan dalga boyu aralığında ışık<br />
emilimini etkileyebilirler. Bu nedenle bazı durumlarda DNA analizi spektrofotometrik yöntemlerle zor olabilir.<br />
Son yıllarda DNA derişimi <strong>ve</strong> saflığı çok küçük hacimlerde (1µL) ölçüm yapabilen özel spektrofotometreler aracılığıyla<br />
yapılabilmektedir. Bu aletlerle yapılan analiz de diğer spektrofotometrelerde olduğu gibi 260 nm’de ölçülen<br />
absorbsiyon değerlerine dayanır (bkz 1.2.9).<br />
127
11<br />
Nükleik Asitlerin İşaretlenmesi<br />
• • • •<br />
Ayşegül TOPAL SARIKAYA<br />
Nükleik asitler ilişkili oldukları moleküllerin belirlenebilmesi için çeşitli tekniklerle farklı etiketler kullanılarak<br />
işaretlenirler. Hedef dizilerini saptamak üzere diziye özgü sentez ettirilen oligonükleotidler çeşitli yöntemlerle<br />
işaretlenerek pek çok biyolojik olayda <strong>ve</strong> adli uygulamada yaygın şekilde kullanılmaktadır. Radyoaktif işaretlemenin<br />
yanı sıra floresan boyalar, biotin, dioksigenin <strong>ve</strong> enzimler yoluyla da işaretlemeler yapılmaktadır. İşaretlenen nükleik<br />
asit moleküllerine prob (sonda) adı <strong>ve</strong>rilmektedir. İşaretlenmiş nükleik asitlerin kullanımıyla neredeyse yok denecek<br />
kadar az miktarlardaki nükleik asitleri saptamak mümkündür. Bu şekilde transkripsiyon ürünü olan 1 pikogram’dan<br />
daha az miktardaki RNA molekülleri ölçülebilir. Aynı miktardaki nükleik asitleri UV ışıma <strong>ve</strong>ya boyamayla saptamak<br />
olanaklı değildir.<br />
Radyoaktif olmayan etiketler sentetik oligonükleotidlere <strong>ve</strong> büyük DNA moleküllerine PCR aracılığıyla <strong>ve</strong>ya in vitro<br />
biyokimyasal yöntemlerle sokulabilir. Kimyasal yöntemlerle yapılan oligonükleotid işaretleme miligram <strong>ve</strong> üzeri<br />
miktarlarda yapılabilirken enzimatik yöntemlerle mikrogram düzeyine kadar inilebilmektedir.<br />
Uygun işaretleme yöntemini belirlemek için aşağıdaki ölçütleri dikkate almakta yarar vardır.<br />
• İşaretlemede kullanılacak etiket basit <strong>ve</strong> ucuz olmalı; tekrarlanabilir bir protokol kullanarak ılımlı koşullarda<br />
kolaylıkla eklenebilmelidir.<br />
• Yöntem, etiketin sinyal üretme özelliklerini engellememeli <strong>ve</strong>ya hedef diziyle melezlenmesini etkilememelidir.<br />
• Etiket çok düşük derişimlerde bile saptanabilmelidir.<br />
• Bazı durumlarda çoklu etiketleme yapmak avantajlı olabilir. Etiket bu tür uygulamalara el<strong>ve</strong>rişli olmalıdır.<br />
• Etiket, melezleme koşullarında yüksek sıcaklıkta (96°C), yüksek pH’da (pH 9) <strong>ve</strong> deterjan içeren tamponlarda<br />
kararlı olmalıdır.<br />
• Etiket -20°C’da uzun süreli saklamalarda kararlı olmalı <strong>ve</strong> atık sorunu bulunmamalıdır.<br />
• Yöntem eş zamanlı olarak birden fazla farklı etiketi <strong>ve</strong> etiketler arasındaki farkı da saptayabilmelidir.<br />
11.1. Radyoaktif İşaretleme<br />
Problar radyoaktif deoksiribonükleotid trifosfatların (H 3 , I 125 <strong>ve</strong> C 14 ) enzimatik reaksiyonlarla nükleik asitlerin yapısına<br />
sokulmasıyla elde edilebilir. İşaretlemede çentik hareketi (“nick translation”) <strong>ve</strong> terminal transferaz enzimi aracılığıyla<br />
gerçekleştirilen 3’ ucu değiştirme teknikleri kullanılır. 5’-ucun radyoaktif işaretlenmesi γ 32 P-ATP <strong>ve</strong> T4 polinükleotid<br />
kinaz enzimi kullanılarak fosforilleme yoluyla sağlanır. Radyoaktif işaretleme yüksek duyarlılıkta olmakla birlikte<br />
radyoaktif maddelerin kullanımındaki tehlikeler, yarılanma ömürleri, maliyetleri <strong>ve</strong> atıklarının ortadan kaldırılması<br />
gibi zorlukları nedeniyle pek avantajlı bir yöntem de değildir. Ayrıca kinaz enzimi ile yapılan P 32 işaretlemesi sadece<br />
küçük ölçekte başarıyla kullanılabilir. Prob geliştirmede önceleri radyoaktif moleküller kullanılırken günümüzde<br />
139
12<br />
Nükleik Asit Melezleme <strong>Yöntemleri</strong><br />
• • • •<br />
Ayşegül TOPAL SARIKAYA<br />
Nükleik asit melezlemesi (hibridizasyonu) moleküler genetikte kullanılan en temel yöntemlerden biridir. Bu yöntem,<br />
karışık hedef dizilerin oluşturduğu heterojen bir karışımdan işaretli bir prob (sonda) (bkz. Bölüm 11) yardımıyla hedef<br />
dizinin seçilmesini sağlar. Prob <strong>ve</strong> hedef dizi başlangıçta çift iplikli olduklarında sıcaklık <strong>ve</strong>ya baz uygulamasıyla<br />
tek iplikli duruma getirilir. Proba <strong>ve</strong> hedef dizilere ait tek ipliklerin karıştırılması sonucunda birbirini tamamlayan<br />
diziler yeniden birleşerek çift iplikli melez moleküller oluştururlar. Probun hedef nükleik asit ipliğiyle tamamlayıcı<br />
olarak eşleşmesi (“annealing”) sonucunda nükleik asit melezleme testi için önemli olan işaretlenmiş prob/hedef<br />
heterodupleksi oluşur. Melezlemede rol oynayan en temel molekül olan probun geliştirilmesi Bölüm 11’de açıklanan<br />
enzimler kullanılarak gerçekleştirilir. Nükleik asitlerin tipi, kökeni, başlangıç materyalinin özellikleri <strong>ve</strong> etiketleme<br />
yöntemlerine göre çeşitli melezleme probları elde edilebilir (Şekil 12.1).<br />
Melezleme<br />
probları<br />
Tip<br />
DNA<br />
RNA<br />
Oligonükleotid<br />
Köken<br />
Hücre temelli DNA<br />
klonlaması <strong>ve</strong>ya PCR<br />
Uygun <strong>ve</strong>ktörde,<br />
klonlanmış DNA’nın<br />
transkripsiyonu<br />
Kimyasal sentez<br />
Başlangıç<br />
materyalinin<br />
özelliği<br />
Çift iplikli, geleneksel<br />
DNA klonları için 0.1–>100 kb,<br />
PCR ürünleri için 0.1–>20 kb<br />
Tek iplikli,<br />
genellikle birkaç<br />
bin nükleotid<br />
boyunda<br />
Tek iplikli,<br />
genellikle 15-50 baz<br />
uzunlukta<br />
İşaretleme<br />
Genellikle DNA polimeraz<br />
temelli DNA ipliği sentezi<br />
Klonlanmış DNA’nın<br />
transkripsiyonu<br />
Uç işaretleme<br />
(örneğin, polinükleotid<br />
kinazla)<br />
Şekil 12.1. Nükleik asit melezleme probları (Strachan <strong>ve</strong> Read’den).<br />
145
12.A<br />
Southern Melezleme: HyHel 10 ScFv Geninin Prob Olarak<br />
İşaretlenmesi <strong>ve</strong> Belirlenmesi<br />
Şule ARI<br />
İstenilen bir genin <strong>ve</strong>ya DNA dizisinin, binlerce baz çiftlik bir DNA molekülü içindeki varlığının belirlenmesi, moleküler<br />
biyoloji <strong>ve</strong> rekombinant DNA teknolojisi çalışmaları için önemli <strong>ve</strong> vazgeçilmez işlemlerden biridir. Özellikle gen<br />
yapısı, gen anlatımı, genom organizasyonu, haritalama <strong>ve</strong> gen aktarımı çalışmalarında (transformantların istenilen<br />
geni taşıyıp taşımadığının, kopya sayısının analizi vb) aranılan DNA dizisinin saptanması Southern damgalama<br />
(“blotting”) tekniği ile mümkün olabilmektedir. Bu teknik ilk kez adını aldığı Southern tarafından 1975 yılında<br />
tanımlanmıştır. Bu tekniğin temeli, istenilen DNA parçasının ona tamamlayıcı olan <strong>ve</strong> (radyoaktif <strong>ve</strong>ya radyoaktif<br />
olmayan) bazı belirleyicilerle işaretlenmiş probların (bkz. Bölüm 11) kullanılarak melezlenmesine <strong>ve</strong> melezlemenin<br />
ardından belirleyicinin özelliğine göre otoradyografik, immünolojik, kimyasal ya da floresan yöntemlerle görünür<br />
hale getirilmesine dayanır. Otoradyografinin hızlı sonuç <strong>ve</strong>rmesi, gü<strong>ve</strong>nilirliği gibi üstün özelliklerinin yanı sıra<br />
radyoaktif maddelerle çalışmanın getirdiği zorluklar <strong>ve</strong> tehlikeler sistemin en önemli dezavantajını oluşturmaktadır.<br />
Bu durum araştırıcıları daha tehlikesiz yöntemler geliştirmeye yöneltmiştir. Bu yöntemlerin tümünün ortak özelliği<br />
işaretlemenin radyoaktif olmayan belirleyicilerle yapılmasıdır. Radyoaktif olmayan işaretleme <strong>ve</strong> belirleme sistemleri<br />
(1) digoksigenin-anti-digoksigenin sistemi, (2) yabanturpu (Armoracia lapathifolia, “horseradish”) peroksidaz sistemi,<br />
(3) biotin-streptavidin sistemi olarak sıralanabilir. Bu üç sistemle de melezlenen probun belirlenmesi kromogenik<br />
(kolorimetrik) yani renkli bir ürün oluşturan <strong>ve</strong>ya ışık oluşumuna neden olan (kemoluminogenik) substratlar<br />
kullanılarak gerçekleştirilir.<br />
Digoksigenin (DIG) Sistemi: Prob İşaretlenmesi <strong>ve</strong> Belirleme<br />
Bu belirleme yöntemi, otoradyografi ile aynı temel prensibe dayanır. Bununla birlikte, radyoaktif madde<br />
gerektirmeyen gü<strong>ve</strong>nli kullanımı, kolay uygulanabilir olması, hızlı sonuç <strong>ve</strong>rmesi, özgüllüğü <strong>ve</strong> duyarlılığı gibi<br />
nedenlerden ötürü otoradyografiye göre önemli avantajlara sahiptir. Ayrıca hazırlanan probların bir yıldan daha<br />
uzun bir süre kararlı durumda kalması <strong>ve</strong> birden fazla deneyde kullanılabilmesi de digoksigenin (DIG) sisteminin<br />
diğer üstünlüklerindendir.<br />
DIG işaretleme sisteminde, DNA, RNA <strong>ve</strong> oligonükleotidlerin işaretlenmesinde Digitalis bitkisinden elde edilen bir<br />
kardenolid steroid hapten olan digoksigenin kullanılır. Prob hazırlamada kullanılan digoksigenin, bir nükleotid<br />
trifosfat analoğu olan digoksigenin-11 dUTP (DIG-11-dUTP) yapısında, urasile bağlı olarak yer alır (Şekil 1). In vitro<br />
DNA sentezi reaksiyonu şeklinde gerçekleşen prob hazırlanması sırasında ortama dört çeşit dNTP’nin yanısıra DIG-<br />
11-dUTP de eklenir. Bu nedenle, belirlenmesi istenen DNA dizisinin tamamlayıcısı olan probun sentezi sırasında<br />
yapıya, kalıp DNA ipliğindeki her adenin nükleotidinin karşılığı olarak ya dTTP ya da DIG-11-dUTP girer.<br />
Şekil 1. Digoksigenin-UTP (R1=OH, R2=OH), digoksigenin-dUTP (R1=OH, R2=H) <strong>ve</strong> digoksigenin-ddUTP (R1=H, R2=H)’nin ortak<br />
kimyasal formülü.<br />
149
12.B Northern Melezleme: Genel Uygulama Örneği<br />
Ayşegül TOPAL SARIKAYA<br />
Gerekli Malzemeler<br />
Membran<br />
_ Northern melezleme için genellikle naylon membran tercih edilir. Fakat bu malzeme organik çözücüler etkisinde<br />
bırakıldığında küçülebilir <strong>ve</strong>ya katlanabilir. Nitroselüloz membranlar ise sabitleme (fiksasyon) işlemindeki fırınlama<br />
sırasında yanabilir <strong>ve</strong>/<strong>ve</strong>ya yıkama sırasında kolayca yırtılabilir.<br />
Denatürasyon çözeltisi<br />
NaOH. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .50 mM<br />
NaCl. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10 mM<br />
Nötralizasyon çözeltisi<br />
Tris pH 7.5 . . . . . . . . . . . . . . . . .100 mM<br />
Melezleme öncesi tamponu<br />
Sodyum dodesil sülfat (SDS) . . . . . %7<br />
Sodyum fosfat, pH 7.0 . . . . . . . . . 50 mM<br />
Formamid . . . . . . . . . . . . . . . . .%50<br />
Bloklama ajanı . . . . . . . . . . . . . . %2<br />
SSC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5x (sodyum sitrat 0.075 M, sodyum klorür 0.75 M)<br />
Laurilsarkosin. . . . . . . . . . . . . . .%0.01<br />
_ Bloklama ajanı kit içerisinde toz halinde bulunur <strong>ve</strong> yıkama çözeltisi 1 içinde çözündürülerek hazırlanır. Ayrıca,<br />
bloklama ajanı olarak olarak yağsız süt tozu da kullanılabilir.<br />
Northern melezleme tamponu<br />
5-25 ng/mL prob içeren melezleme öncesi tamponu<br />
Yıkama çözeltisi-1<br />
SSC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2x<br />
SDS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %0.1<br />
Yıkama çözeltisi-2<br />
SSC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.1x<br />
SDS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %0.1<br />
İmmünolojik saptamada kullanılan çözeltiler:<br />
Tampon-1<br />
Maleik asit. . . . . . . . . . . . . . . . .150 mM<br />
NaCl. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 150 mM<br />
Tampon-2<br />
Bloklama ajanı stok çözeltisi . . . . . %1<br />
157
13<br />
In situ Melezleme<br />
• • • •<br />
Selma YILMAZER, Melek ÖZTÜRK, Fatma KAYA DAĞISTANLI<br />
In situ melezleme (“in situ hybridization”, ISH), nükleik asit dizilerinin (DNA <strong>ve</strong> RNA) morfolojik olarak korunmuş<br />
kromozomlar, hücreler <strong>ve</strong>ya doku kesitlerinde saptanarak gösterilmesini sağlayan <strong>ve</strong> temel olarak çift iplikli nükleik<br />
asit oluşumu kinetiğini kullanan güçlü bir tekniktir. Bu tekniğin melezlemeye dayalı diğer yöntemlerden (örneğin,<br />
Southern <strong>ve</strong>ya Northern melezleme) farkı nükleik asitlerin kendi hücresel ortamlarında tanınarak gösterilmesidir.<br />
Böylece hedef nükleik asit dizisinin hücredeki yeri belirlenmiş olur.<br />
Nükleik asitlerin bulundukları yerde saptanması:<br />
• Kromozomların fiziksel haritalarının yapılmasında,<br />
• Kromozom yapı <strong>ve</strong> hatalarının analizinde,<br />
• Kromozomların <strong>ve</strong> genomun yapı, işlev <strong>ve</strong> evriminin araştırılmasında,<br />
• Gen anlatımının izlenmesinde,<br />
• Eşey tayininde,<br />
• Dokudaki virüs <strong>ve</strong> bakterilerin tanısında,<br />
• Transformasyon dizilerinin <strong>ve</strong> onkogenlerin yerlerinin belirlenmesinde önemlidir.<br />
Buna göre, in situ melezleme ile birçok temel biyolojik soru yanıtlanmaktadır. Ayrıca bu yöntem tıbbi araştırma <strong>ve</strong> tanı<br />
yanında, bitki yetiştirme programlarında da önemli bir kullanım alanı bulmaktadır. In situ melezlemenin anlaşılması<br />
moleküler biyoloji, genetik, immünokimya <strong>ve</strong> histokimya bilgilerini gerektirir. Yöntemin başlıca aşamaları Şekil<br />
13.1’de gösterilmiştir. <strong>Biyoloji</strong>k materyalin hazırlanması <strong>ve</strong> nükleik asit dizisinin prob elde etmek üzere, radyoaktif<br />
<strong>ve</strong>ya radyoaktif olmayan bir işaretleyici ile işaretlenmesi ilk işlemlerdir. Daha sonra nükleik asitleri tek iplikli hale<br />
getirmek için hem prob, hem de materyal denatürasyona uğratılır. Bir sonraki aşamada ise tek iplikli prob, kontrollü<br />
deneysel koşullar altında, biyolojik materyaldeki tek iplikli tamamlayıcı nükleik asit dizisi (hedef dizi) ile melez<br />
(hibrid) oluşturur. Böylece yeni bir çift iplikli molekül oluşur. En son aşamada işaretleyiciyi taşıyan bu moleküldeki<br />
melezleme bölgeleri saptanarak görünür hale getirilir.<br />
ISH yöntemi ilk kez 1969’da birbirinden bağımsız olarak çalışan iki grup araştırıcı tarafından (John <strong>ve</strong> ark., Pardue<br />
<strong>ve</strong> Gall) uygulanmıştır. İlk uygulamalarda nükleik asitleri işaretlemede radyoizotoplar kullanılmaktaydı; buna<br />
göre melezleşmiş dizileri göstermek için başvurulan tek yöntem otoradyografiydi. Ayrıca, o tarihlerde henüz<br />
moleküler klonlama yapılamadığından ISH sadece biyokimyasal yöntemlerle izole edilebilen <strong>ve</strong> saflaştırılabilen<br />
dizilere (örneğin, fare satellit DNA’sı, viral DNA, ribozomal RNA vb.) uygulanabiliyordu. <strong>Moleküler</strong> klonlanma <strong>ve</strong><br />
radyoaktif işaretleme tekniklerindeki gelişmeler bu tabloyu önemli derecede değiştirdi. Öte yandan, radyoaktif<br />
olmayan işaretleyicilerle hazırlanmış nükleik asit problarının ISH’da kullanılması radyoaktif yöntemin getirdiği<br />
zorlukları ortadan kaldırdı. Radyoaktif olmayan ISH ilk kez 1970’lerin sonunda uygulandı (Rudkin <strong>ve</strong> Stollar, 1977;<br />
161
14<br />
DNA/DNA in situ Melezleme:<br />
Kromozomlarda Floresan in situ<br />
Melezleme (FISH) Yöntemi<br />
• • • •<br />
Selma YILMAZER, R.Dilhan KURU<br />
DNA/DNA in situ melezlemesi (“In Situ Hybridization”, ISH), özgün bir DNA dizisinin işaretli problar (sondalar)<br />
aracılığıyla kromozomlarda (metafaz yayma preparatlarında <strong>ve</strong>ya interfaz nükleusunda) gösterilmesini sağlayan<br />
güçlü bir tekniktir. Özgün DNA dizilerinin kromozomlar üzerinde yerleştiği yeri belirlemek <strong>ve</strong> kromozomların fiziksel<br />
haritasını çıkarmak için kullanılır. Kromozomal ISH, denatürasyona uğratılmış kromozomal DNA’daki hedef dizinin<br />
işaretli bir probla melezlenmesi işlemi olup, gen <strong>ve</strong> genom yapı, işlev, organizasyon <strong>ve</strong> evriminin aydınlatılması<br />
konularında önemli katkılar yapmıştır. DNA dizi bilgisinin kromozom yapısı <strong>ve</strong> gen anlatımıyla ilişkilendirilmesini<br />
mümkün kılmış <strong>ve</strong> böylece sitogenetikte geniş bir uygulama alanı bulmuştur.<br />
Belirli genlerin <strong>ve</strong>ya DNA dizilerinin kromozomlar üzerinde haritalanması için en çok kullanılan yöntemlerden biri<br />
olan ISH’nın metafaz yayma preparatlarına uygulanmasıyla ilgilenilen genler insan kromozomları üzerinde doğrudan<br />
görüntülenebilmektedir. Teknik sadece insan gen haritası için bir temel oluşturmakla kalmamış, aynı zamanda<br />
genetik hastalıklara <strong>ve</strong> kansere neden olan genlerin <strong>ve</strong>ya ilgilenilen herhangi bir genin moleküler klonlanması<br />
için de önemli bir <strong>ve</strong>ri tabanı sağlamıştır. Ek olarak metafazda, interfazda <strong>ve</strong> mayozda DNA dizilerinin yerleşimini<br />
araştırmak, evrim sırasında, gelişim sırasında <strong>ve</strong> hastalık koşullarında kromozomların yeniden düzenlenmelerini <strong>ve</strong><br />
dizi kopya sayısındaki değişikliklerini göstermek için kullanılmaktadır.<br />
Yöntemin ilk uygulamalarında tek kopyalı genler radyoaktif işaretli (H 3 <strong>ve</strong>ya P 32 ) problar ile işaretlendikten sonra<br />
otoradyografi yöntemiyle gösterilmiştir. Radyoaktif tekniğin içerdiği birtakım sorunlar nedeniyle daha sonraki<br />
yıllarda radyoaktif işaretli problarla aynı duyarlılık <strong>ve</strong> çözünürlüğe sahip izotopik olmayan moleküllerin kullanıldığı<br />
yöntemler bulmak için harcanan yoğun çabalar sonucu florokromlar <strong>ve</strong>ya biotin <strong>ve</strong> digoksigenin gibi diğer işaretleyici<br />
moleküller prob işaretlemede kullanılmaya başlanmıştır (bkz. Tablo 13.2). Biotin <strong>ve</strong> digoksigeninin görüntülenmesi<br />
için floresan işaretli antikorlar kullanılarak immünositokimyasal yöntemler uygulanmıştır. Prob, floresan boyalarla<br />
işaretlenmiş ise teknik floresan in situ melezleme (“Fluorescent In Situ Hybridization”, FISH) adını alır. Günümüzde<br />
kromozomal ISH için kullanılan yöntemlerin hemen tümü FISH yönteminden kökenlenir. Bu yöntem Pinkel <strong>ve</strong> ark.<br />
tarafından geliştirilmiştir.<br />
Floresan işaretli problar kullanıldığında kromozom yaymasındaki melezlenme noktalarını görüntülemek için<br />
floresans mikroskobu gereklidir (bkz. 1.2.13). FISH’de prob işaretleyiciler, doğrudan proba bağlanan florokromlar<br />
<strong>ve</strong>ya floresan işaretli reaktifler <strong>ve</strong> antikorlarla belirlenebilen biotin <strong>ve</strong> digoksigenin gibi diğer moleküller olabilir.<br />
Kromozomal ISH, FISH tekniğinin kullanıma girmesiyle birlikte çok önemli bir aşama kaydetmiştir. Kromozomal hedef<br />
dizilere uygulanan DNA in situ melezlemesi günümüzde FISH ile eş anlamlı olarak kullanılmaktadır. Melezlenme<br />
sinyallerinin floresan yöntemle gösterilmesi diğer yöntemlere göre çözünürlük, kontrast, hızlı <strong>ve</strong> gü<strong>ve</strong>nli kullanım<br />
179
15<br />
Rekombinant DNA Teknolojisi<br />
• • • •<br />
Güler TEMİZKAN, Nermin GÖZÜKIRMIZI<br />
<strong>Moleküler</strong> biyolojide önceleri daha çok dolaylı yöntemlerle yapılan çalışmalara dayanan bilgiler 1970’li yılların<br />
başlarından itibaren doğrudan nükleik asit molekülleri düzeyindeki çalışmalardan elde edilir duruma gelmiştir.<br />
Rekombinant DNA teknolojisi (bazen aynı anlamda <strong>ve</strong> daha popüler olarak kullanılan terimle genetik<br />
mühendisliği ya da gen mühendisliği) olarak adlandırılan <strong>ve</strong> deneysel biyolojide bir devrim olarak kabul edilen<br />
metodoloji sayesinde genlerin yapı <strong>ve</strong> işlevlerine ilişkin bilgilerde çok hızlı artışlar sağlanmıştır.<br />
Bu teknolojinin en önemli bilimsel temeli olan rekombinasyonun uzun yıllardan beri tanımlanmış olan <strong>ve</strong> tüm<br />
organizma gruplarında doğal olarak meydana gelen tipi olan homolog (genel) rekombinasyon, DNA molekülleri<br />
arasında homoloji (benzerlik) olmasına dayandığı için, aynı türe ait bireyler arasında ya da çok yakın türler arasında<br />
kısıtlı kalır 1 . Bununla beraber, ilk kez 1973 yılında başta Cohen olmak üzere bir araştırma grubunun başarıyla<br />
uyguladıkları bir yöntem <strong>ve</strong> bunu izleyen çalışmalarla gelişen rekombinant DNA teknolojisi rekombinasyon<br />
olayının, farklı kökenli DNA molekülleri arasında istenilen biçimde in vitro gerçekleştirilmesine olanak <strong>ve</strong>rmiştir.<br />
Buna göre, doğada mevcut mekanizmalarla elde edilmesi olanaksız olan yeni gen birlikteliklerinin yapılması<br />
bu teknolojiyle mümkün olmakta, bir organizmanın genotipi önceden belirlenmiş <strong>ve</strong> yönlendirilmiş şekilde<br />
değiştirilebilmektedir.<br />
En geniş anlamda, belli bir amaca yönelik olarak doğrudan nükleik asit molekülleri üzerinde yapılan çalışmaları<br />
kapsayan rekombinant DNA teknolojisiyle kalıtsal molekülde in vitro planlı değişiklikler yapılabilmektedir. Bu<br />
teknoloji bir organizmadan herhangi bir yolla izole edilen bir DNA parçasının (genin) uygun bir konağın içerisine<br />
sokularak orada çoğalmasını (<strong>ve</strong> bazen de) anlatım yapmasını amaçlayan çalışmalara ait tekniklerin toplamıdır.<br />
Genelde izlenen yol, bir organizmadan elde edilen <strong>ve</strong> içinde istenilen geni taşıyan DNA parçalarının, taşıyıcı<br />
özellikte bir DNA molekülüne (<strong>ve</strong>ktör) bağlanarak rekombinant DNA oluşturulması <strong>ve</strong> bu molekülün uygun bir<br />
konak hücreye sokularak orada çoğaltılmasıdır. Gen (ya da DNA) klonlaması olarak adlandırılan bu süreçte konak<br />
hücreler çoğaldıkça rekombinant DNA molekülleri döllere geçerler. Çok sayıda hücre bölünmesini takiben oluşan<br />
1 Homolog rekombinasyon, farklı nükleotid dizilerine sahip iki DNA molekülünün homoloji gösteren bölgeleri arasındaki parça alış <strong>ve</strong>rişi<br />
sonucunda meydana gelen yeni gruplanmalardır. Bunun için DNA moleküllerinde meydana gelen kırılma bölgelerinde moleküller arasında<br />
parça alış <strong>ve</strong>rişi meydana gelir. Sonuçta orijinal durumdaki DNA moleküllerine tam olarak benzemeyen <strong>ve</strong> onlara ait nükleotid dizilerini kısmen<br />
taşıyan DNA molekülleri (rekombinant moleküller) oluşur. Homolog rekombinasyon, ökaryotlarda genelde mayoz bölünmedeki krosingo<strong>ve</strong>r<br />
olayı sonucunda, bakterilerde ise, mekanizmaları farklı olmakla birlikte transformasyon, konjugasyon <strong>ve</strong> transdüksiyon olaylarıyla meydana<br />
gelmektedir. Doğal olarak meydana gelen <strong>ve</strong> homolog olmayan rekombinasyona yol açan transpozisyon da doğrudan bir bireyin genomunda<br />
yeni düzenlenmeler meydana getirdiği için birey düzeyinde kısıtlı kalır.<br />
195
15.A Bakteri Transformasyonu<br />
Ayşegül Topal Sarıkaya<br />
Transformasyon Streptococcus, Bacillus, Rhizobium, Salmonella, Pneumococcus gibi bakteri gruplarında doğada<br />
kendiliğinden oluşmaktadır. Fakat oluşum sıklığı oldukça düşüktür. Laboratuvar koşullarında ise alıcı özelliği olmayan<br />
türlerin (örneğin, Escherichia coli) hücrelerine bazı kimyasal <strong>ve</strong> fiziksel uygulamalarla bu özellik kazandırılabilir <strong>ve</strong><br />
istenen DNA molekülleri bu hücrelere başarılı şekilde aktarılır. Transformasyon etkinliği ortamda bulunan DNA<br />
derişimiyle doğru orantılı olarak artar. Ancak DNA derişimi belli bir değere ulaştığında transformantların sayısında<br />
artık artış olmaz. Bu da alıcı hücrenin DNA’yı alabilme doygunluğuna ulaştığını gösterir.<br />
Alıcı özelliğe sahip bakteri türlerinin DNA molekülünü hücre içine alabilme yeteneği oldukça düşüktür. Bununla<br />
beraber bu yeterlik (kompetans) türden türe değişkenlik gösterebilir. Yeterlik mekanizmasını anlayabilmek<br />
için öncelikle bu özellikte etkili olan ürünleri şifreleyen genlerin tanımlanması <strong>ve</strong> bu genlerin anlatımlarının<br />
düzenlenmesinin bilinmesi gerekir. Bacillus subtilis ile yapılan çalışmalarda, hücre sayısındaki artışın zardaki algılayıcı<br />
proteinin kinaz aktivitesi göstererek kendisini fosforillemesine, daha sonra da fosfat grubunun düzenleyici proteine<br />
aktarılmasına neden olduğu anlaşılmıştır. Düzenleyici protein yeterlik için gerekli olan operon da dahil olmak üzere<br />
birçok gen için transkripsiyon aktifleştiricisidir. Yeterlik özelliği, hücrelerin salgıladığı yeterlik faktörü adı <strong>ve</strong>rilen küçük<br />
peptidlerin varlığına da bağlıdır. Yeterlik hücre duvarında bulunan <strong>ve</strong> DNA’ların bağlanmasını sağlayan bazı alıcıların<br />
(reseptörlerin) aktifleşmesine yol açar. Yeterlik özelliği kültürde genellikle geç logaritmik evrede ortaya çıkar. Ayrıca<br />
kültürün havalandırma derecesi <strong>ve</strong> üreme ortamı da bu özelliği etkileyen faktörlerdir. Maksimum düzeyde yeterlik<br />
sağlayabilmek için kullanılan besiyeri <strong>ve</strong> üreme koşulları bir bakteri türünden diğerine değişiklik gösterebilir.<br />
Transformasyon iki aşamadan oluşur. Birinci aşamada geri dönüşümlü bir şekilde hücre duvarına özgül alıcılar<br />
aracılığıyla bağlanan DNA, ikinci aşamada enerji gerektiren bir süreçle hücre içine girer.<br />
Laboratuvar koşullarında bakteri transformasyonu, ilk kez soğuk CaCl 2<br />
çözeltisinde bekletilmiş E. coli hücrelerinin<br />
kısa bir süre yüksek sıcaklık şokunda tutulması sonucunda yeterli (kompetant) duruma getirilmesi <strong>ve</strong> yabancı<br />
DNA’nın bu hücreler tarafından alınması ile gerçekleştirilmiştir. Daha sonraları bu temel teknik, hücrelerin CaCl 2<br />
<strong>ve</strong> diğer divalent katyonların klorürleri etkisinde daha uzun süre tutulması <strong>ve</strong>ya DMSO <strong>ve</strong> hekzamin kobalt klorür<br />
etkisinde bırakılması gibi çeşitli uygulamalarla geliştirilerek transformasyon etkinliği 10 7 -10 8 transformant/µg DNA<br />
olacak şekilde artırılmıştır.<br />
Kimyasal yöntemlerle yeterli hücre oluşturmanın yanı sıra elektrik akımıyla hücre içerisine doğrudan DNA aktarımı<br />
(elektroporasyon) (bkz. 15.1.4) da bir başka transformasyon tekniğidir. Elektroporasyon, başlangıçta memeli<br />
hücrelerine DNA sokmak için kullanılmış, ancak daha sonraları çeşitli bitki, bakteri <strong>ve</strong> maya türlerine DNA aktarımında<br />
da uygulanmaya başlamıştır. Elektroporasyon yüksek transformasyon etkinliğine (10 9 -10 10 transformant/µg DNA)<br />
yol açmakla birlikte oldukça pahalı aletler gerektiren bir yöntemdir.<br />
Kimyasal Uygulama ile Transformasyon<br />
Organizma<br />
Escherichia coli<br />
Gerekli Malzemeler<br />
LB (Luria-Bertani) besiyeri<br />
“Bacto-tryptone”. . . . . . . . . . . . .%1<br />
“Bacto-yeast extract” . . . . . . . . . .%0.5<br />
NaCl. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .%1<br />
_ Bütün maddeler karıştırıldıktan sonra 5 N NaOH ile pH 7.0’ye ayarlanır.<br />
277
15.B<br />
Schizosaccharomyces pombe İnozin Monofosfat<br />
Dehidrogenaz (gua1) Geninin Klonlanması<br />
Semian KARAER UZUNER, Güler TEMİZKAN<br />
Bu uygulama örneğinde, Schizosaccharomyces pombe maya türünde pürin nükleotidleri biyosentezinde iş gören ilk<br />
enzimi şifreleyen inozin monofosfat dehidrogenaz (gua1) geninin izolasyonu, klonlanması <strong>ve</strong> yapı analizine ilişkin<br />
yöntemler <strong>ve</strong>rilmiştir.<br />
Materyal<br />
Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) maya türüne ait yabani (972h - , 975h + ) <strong>ve</strong> mutant (gua1ura4 -D18 h - ) ırklar<br />
Escherichia coli DH5a ırkı<br />
S. pombe’nin pUR19/Sau3A’da kurulmuş genom kitaplığı<br />
pUR19 (maya mekik tipi klonlama <strong>ve</strong>ktörü)<br />
pREP42 (maya mekik tipi anlatım <strong>ve</strong>ktörü)<br />
pUC18 (bakteri klonlama <strong>ve</strong>ktörü)<br />
Gerekli Malzemeler<br />
S. pombe Transformasyonu<br />
“Yeast extract agar” (YEA)<br />
“Yeast extract” . . . . . . . . . . . . . . %0.5<br />
Glukoz . . . . . . . . . . . . . . . . . . .%3<br />
Agar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %1.8<br />
Sentetik minimal besi ortamı (YNB)<br />
“Yeast nitrogen base”. . . . . . . . . .%0.17 (w/v)<br />
Glukoz . . . . . . . . . . . . . . . . . . .%2 (w/v)<br />
(NH 4<br />
) 2<br />
SO 4<br />
. . . . . . . . . . . . . . . . . %0.5 (w/v)<br />
Otaklavda steril edildikten sonra guanin (50 mg/mL) <strong>ve</strong> urasil (50 mg/mL) eklenir.<br />
Lityum asetat /EDTA (LiAc/EDTA) tamponu, pH 4.9<br />
LiAc . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .100 mM<br />
EDTA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 mM<br />
%40 polietilen glikol (PEG) tamponu, pH 4.9<br />
LiAc . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .100 mM<br />
EDTA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 mM<br />
PEG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %40 (w/v)<br />
S. pombe’den Plazmid DNA’sı İzolasyonu<br />
Zenginleştirilmiş sentetik besi ortamı (SCM)<br />
“Yeast nitrogen base” (w/o amino asit) . . %0.17 (w/v)<br />
(NH 4<br />
) 2<br />
SO 4<br />
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %0.5 (w/v)<br />
Glukoz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %2 (w/v)<br />
Otaklavda steril edildikten sonra besi ortamına adenin, arginin, histidin, metionin, triptofan <strong>ve</strong> urasil (20 mg/mL),<br />
izolösin, lizin <strong>ve</strong> tirozin (30 mg/mL), fenilalanin (50 mg/mL), lösin (60 mg/mL) <strong>ve</strong> valin (150 mg/mL) eklenir.<br />
281
16<br />
DNA’nın Polimeraz Zincir Reaksiyonu<br />
(PCR) ile Çoğaltılması<br />
• • • •<br />
Şule ARI<br />
<strong>Moleküler</strong> biyolojik çalışmaların en temel uygulamalarından biri, DNA’nın in vitro koşullarda çoğaltılmasıdır. Bu<br />
işlem belli bir DNA parçasının bol miktarda elde edilmesi, moleküler analizinin yapılması <strong>ve</strong> genetik mühendisliği<br />
amaçları doğrultusunda rekombinant organizmalar elde etmek üzere gen aktarımı için kullanılması gibi amaçlarla<br />
yürütülür.<br />
Hücrelerde DNA doğal olarak replikasyonla çoğalır. DNA çift sarmalında birbirinden ayrılan ipliklerin tamamlayıcıları<br />
sentezlenerek bir DNA molekülünden onunla aynı olan iki yavru molekül meydana gelir. Buna göre de hücre<br />
bölünmesiyle yeni oluşan hücrelere tüm genler aynen geçerler. Her yeni hücre dölünde genlerin kopya sayılarının iki<br />
katına çıkması nedeniyle kuşaklar boyunca DNA miktarı başlangıca göre üssel olarak artar. Örneğin 30 kuşak sonra<br />
hücre <strong>ve</strong> gen sayısında milyarlarca kez artış olur. In vitro koşullarda istenilen bir genin ya da özgün bir DNA dizisinin<br />
çok sayıda kopyasının elde edilmesi için rekombinant DNA yöntemleri ile DNA klonlamasına ek olarak, 1980’li<br />
yıllardan itibaren Polimeraz Zincir Reaksiyonu (“Polymerase Chain Reaction”, PCR) da kullanılmaya başlanmıştır<br />
(bkz. 15.1.2). PCR ile istenilen genlerin ya da DNA dizilerinin replikasyonu hızlandırılmış bir şekilde gerçekleştirilir.<br />
Bu reaksiyon, aynen doğal hücre bölünmesinde olduğu gibi, replikasyon sürecini taklit ederek yaklaşık 30 döngü<br />
sonunda seçilmiş bir DNA dizisinin aşağı yukarı milyar katını kopyalar.<br />
PCR, özel bir DNA parçasının kopyalarının primerler tarafından yönlendirilerek enzimatik olarak sentezlenmesi<br />
şeklinde tanımlanan in vitro bir yöntemdir. 1980’li yılların ortalarında Cetus firması araştırıcıları tarafından<br />
geliştirilmesinin ardından temel moleküler biyolojik araştırmalarda (klonlama, dizi analizi <strong>ve</strong> DNA haritalaması gibi)<br />
<strong>ve</strong> birçok hastalığın (orak hücre anemisi, kistik fibrozis, kırılgan X sendromu, AIDS, lösemi vb.) DNA temelli moleküler<br />
tanısı için de klinik tıpta hızla kullanılmaya başlanmıştır. <strong>Moleküler</strong> biyolojide büyük bir bölümü özel bir DNA ya<br />
da RNA parçasının elde edilebilmesine yönelik olarak nükleik asitler ile yapılan çalışmalarda çoğunlukla radyoaktif<br />
maddelerin kullanımını gerektiren melezleme yöntemleri kullanılırken PCR’ın keşfiyle kısa sürede <strong>ve</strong> daha basit<br />
işlem basamaklarıyla DNA eldesi mümkün olmuştur.<br />
PCR ile insan genomik DNA’sı gibi karmaşık yapılı DNA kalıplarından özel DNA parçaları gibi farklı özellikte DNA’ların<br />
sentezinin birkaç saat içinde gerçekleştirilebilmesi, bu teknolojinin yaygınlaşmasında başlıca neden olmuştur.<br />
PCR’nin çok az miktarlardaki hedef DNA moleküllerinden belli bir bölgeyi fazla miktarda çoğaltabilme özelliği, bu<br />
tekniğin özellikle örnek miktarının az olduğu klinik olgularda yaygın bir biçimde kullanılabilmesini sağlamıştır.<br />
Böylece örneğin, düşük titreli virüs enfeksiyonlarını tanılamak, lösemi hastalarında minimal hastalık kalıntısını<br />
belirlemek <strong>ve</strong> tümör dokularındaki nokta mutasyonlarını ya da gen değişimlerini saptayabilmek olası hale gelmiştir.<br />
Ayrıca günümüzde, allelik dizi çeşitliliğinin (varyasyonunun) gösterilebilmesiyle doku transplantasyonu için<br />
doku tipinin belirlenmesinde, adli tıp örneklerinin genetik tiplendirilmesinde (örneğin, analık-babalık tayininde),<br />
tarımda (örneğin, tohum saflığının belirlenmesinde), sistematik <strong>ve</strong> evrim çalışmalarında (örneğin, canlı türlerinin<br />
tanımlanmasında, türler arasındaki polimorfizmlerin <strong>ve</strong> akrabalıkların belirlenmesinde) da PCR kullanılmaktadır.<br />
291
GENOMİK ANALİZLER
17<br />
Genom Haritalama <strong>ve</strong> Dizileme<br />
<strong>Yöntemleri</strong><br />
• • • •<br />
Şule ARI<br />
Günümüzde yaşam bilimleri, biyofizik, biyokimya, biyoinformatik, robotiğin moleküler genetiğe katkılarıyla<br />
<strong>ve</strong> 2000’li yıllardan itibaren gelişen omik teknolojileri uygulamaları olan omik analizlerle, hücrenin ortamıyla<br />
ilişkisi düzeyinden en geniş anlamda gelişim <strong>ve</strong> hastalık durumuna kadar karmaşık süreçlerde genotip-fenotip<br />
ilişkisinin kurulmasına odaklanmıştır. <strong>Biyoloji</strong>k aktivitelerin koordinasyonunda genlerin rolleri <strong>ve</strong> etkileşimlerinin<br />
belirlenebilmesi için genomun yapısı <strong>ve</strong> işleviyle ilgili mekanizmaların anlaşılması büyük önem taşıdığından, DNA<br />
dizilenmesi genomik biliminin en temel hedeflerinden biri haline gelmiştir. Genotip-fenotip ilişkisinin kurulması<br />
yolunda en önemli adımlar 1990’da başlatılan İnsan Genom Projesi’nin önünü açtığı genom projeleri ile atılmıştır.<br />
Omik <strong>ve</strong> yüksek işlem hacimli (“High-Throughput”, HT) teknolojilerin gücü, biyolojik sistemlerin yapı <strong>ve</strong> işlevleri<br />
arasındaki karmaşık etkileşimlerin sistematik olarak tanımlanabilmesi için öncelikle bir organizmanın tüm genetik<br />
bilgisini şifreleyen DNA’yı (virüsler gibi örneklerde RNA’yı) taşıyan genomun haritalanması <strong>ve</strong> dizilenmesi için genom<br />
projelerine uygulanmıştır. DNA dizileme teknolojisindeki devrimsel nitelikteki gelişmeler [Yeni Nesil Dizileme (YND)<br />
Teknolojileri] <strong>ve</strong> büyük miktardaki <strong>ve</strong>rileri analiz eden algoritmalar ile bilgisayar yazılımlarının geliştirilmesi hem<br />
dizileme hem de genom analizlerini basitleştirmiştir. Günümüzde açık okuma çerçe<strong>ve</strong>si (“Open Reading Frame”,<br />
ORF), promotör, ekson, intron aranması, dizi hizalaması, protein yapı <strong>ve</strong> işlevinin tahmini gibi çeşitli amaçlarla DNA<br />
dizilerinin analizi için pek çok yazılıma “online” olarak ücretsiz erişim mümkündür. Veri bankalarına girmiş bu genom<br />
bilgilerinin biyoinformatik araçlar kullanılarak sistem biyolojisi <strong>ve</strong> sistem biyolojisine mühendislik bilimlerinin<br />
uygulanmasıyla geliştirilen sentetik biyoloji sayesinde, genomiğin bir bütün olarak bilim, bilgi teknolojileri <strong>ve</strong><br />
endüstri üzerindeki etkileri gelecekte de devam edecektir.<br />
İnsan hastalıklarından, <strong>ve</strong>rim gibi tarımsal özelliklere kadar birçok örnekte karmaşık genotip-fenotip etkileşimlerinin<br />
hakim olması <strong>ve</strong> gen ürünlerinin belirgin biçimde tanımlanmasının mümkün olamaması, bu özelliklerin<br />
anlaşılmasında moleküler klonlama yaklaşımını yetersiz hale getirdiğinden, gen tanımlanmasında çok daha etkin<br />
bir yol olan genom haritalaması stratejisi geliştirilmiştir. Haritalama, dizileme <strong>ve</strong> hesaplamalı analize dayalı genomik<br />
devriminden önce; genlerin genomdaki yerlerinin belirlenmesi olasılık hesaplaması <strong>ve</strong> ardından pozisyonel<br />
klonlamayı gerektirirdi. HT-DNA dizilemesi <strong>ve</strong> büyük miktardaki <strong>ve</strong>rileri analiz eden algoritmaların geliştirilmesi,<br />
sadece genlerin değil hücreye ait olan toplam genetik materyal olan genomun organizasyonuyla ilişkili genom<br />
dizilerinin bütünüyle açıklanmasına olanak <strong>ve</strong>rmiştir. Böylece genom haritalamasıyla genlerin <strong>ve</strong> genleri düzenleyen<br />
elementlerin genomdaki yerleri, genlerdeki tek nükleotid değişimlerinin (“Single Nucleotid Polymorphisms”, SNP’ler),<br />
kopya sayılarındaki değişimlerin (“Copy Number Variations”, CNV’ler) anlaşılması, genomda tek ya da tekrarlı olarak<br />
bulunan çeşitli dizilerin, yalancı genlerin, retrotranspozonların, şifreleme yapmayan RNA’ların (“non coding RNA’s”,<br />
ncRNA’lar) <strong>ve</strong> bu RNA’ların hedef bölgelerinin tanımlanması mümkün hale gelmiştir. Genoma ait bu bilgiler; genlerin<br />
sayılarını, yapılarını, çalışma biçimlerini <strong>ve</strong> bu süreçte iş gören kontrol mekanizmalarını, birbirleriyle etkileşimlerini<br />
<strong>ve</strong> genom dinamiğinin anlaşılmasını sağlayarak biyolojik çeşitliliğin, karmaşık organizma yapısının ya da özetle<br />
yaşamın moleküler temellerinin aydınlatılmasında çok önemli katkılar sağlamaktadır. Ayrıca genom biliminin evrimin<br />
315
18<br />
Transkriptom Analizinin İşlevsel<br />
<strong>Genomik</strong>teki Yeri<br />
• • • •<br />
Gülruh ALBAYRAK<br />
Farklı organizasyon düzeyindeki organizmaların fenotipinin ortaya çıkmasından sorumlu olan <strong>ve</strong> onların kalıtsal<br />
moleküllerinde şifrelenmiş genlerin sayısı günümüzde genom dizi analizlerinin gerçekleştirildiği genom projeleri<br />
ile ortaya konmaktadır (bkz. 17.2). Dizi analizleriyle eş zamanlı olarak genomik, transkriptomik <strong>ve</strong> proteomik gibi<br />
yüksek işlem hacimli analitik yaklaşımlarla da çalışılmaktadır. İşlevsel genomik genlerin işlevlerini belirlemek üzere<br />
yapısal genomun taşıdığı bilgiyi kullanan global deneysel yaklaşımların genom <strong>ve</strong>ya sistem düzeyinde geliştirildiği<br />
<strong>ve</strong> uygulandığı süreçlerin bütününü kapsamaktadır.<br />
Gen anlatımı tüm organizmalarda bireyin yaşamı süresince zamanla (örneğin gelişim sürecinde, değişen koşullara<br />
yanıtta vb.), hatta karmaşık ökaryotlarda bir hücre tipinden diğerine değişmektedir. Bu nedenle belli bir zamanda<br />
örneklenmiş bir dokunun transkriptomu (gen anlatımının transkripsiyon aşaması ürünü olan RNA molekülleri<br />
populasyonu) o organizmanın transkriptomunun sadece bir alt kümesini temsil etmektedir. Transkriptomik,<br />
transkripsiyon ürünleri (mRNA, tRNA, rRNA, şifreleme yapmayan diğer küçük RNA’lar) içerisinde daha çok mRNA<br />
populasyonunun analizini kapsamaktadır. Bir genin anlatım farklılıkları belli biyolojik süreçlerle ilişkili işlevsel gen<br />
gruplarını tanımak amacıyla araştırılmaktadır.<br />
Gen anlatımı profillemesi olarak da ifade edilen gen anlatım farklılıklarının belirlenmesi amacıyla 1980’li yıllardan<br />
günümüze başta melezleme temelli olmak üzere çok sayıda yaklaşım geliştirilmiş <strong>ve</strong> etkin biçimde uygulanmıştır.<br />
Bunlar arasından Northern damgalama (blotlama) (bkz. 12.4), anlatım yapan genlerin varlığı <strong>ve</strong> boyutunu<br />
belirlemeye, hatta transkripsiyon ürünü RNA’ların başlangıç <strong>ve</strong> bitim noktaları ile birlikte gende bulunan intronların<br />
konumlarını saptamaya olanak sağlayan kısaca transkriptler (kopyalar) hakkında temel bilgilerin edinilebildiği bir<br />
yöntemdir. Membran temelli <strong>ve</strong> düşük <strong>ve</strong>rimli ilk yaklaşım olan Northern damgalama, aynı anda birden fazla örnekle<br />
çalışıldığında, değişkene bağlı olarak gen anlatım farklılıklarını da analiz etme olanağını sunmaktadır. İfade edilen<br />
değişkenler; farklı genotipler (yabani tip, mutant vb.), farklı doku tipleri, farklı uygulama süreleri, farklı ortam şartları<br />
olabildiği gibi bunların kombinasyonları şeklinde de olabilmektedir. Değişkene bağlı gen anlatımı profillemesinde<br />
uygulanan yaklaşımlardan biri doğrudan cDNA moleküllerinin dizilemesidir. Bu yöntem geliştirilmiş ilk dijital<br />
teknolojidir. Diğer dijital teknolojilere temel oluşturan cDNA dizilemesi sayesinde kantitatif <strong>ve</strong>rilere ulaşılmış, <strong>ve</strong>ri<br />
bankalarına ilk dizilim bilgileri sağlanmıştır. Ayrıca polimeraz zincir reaksiyonu (“polymerase chain reaction”, PCR)<br />
temelli yaklaşımlar da profillemede uygulama alanı bulmuştur. Bunlar arasından geri transkriptaz PCR (bkz. 16.5.3) <strong>ve</strong><br />
gerçek zamanlı PCR (bkz. Bölüm 21) yöntemleri gen anlatım farklılığını duyarlı biçimde nicel olarak belirleme olanağı<br />
sunduğundan melezleme temelli yaklaşımlara göre daha çok tercih edilmiştir. DNA mikrodizilimleri (bkz. Bölüm 22)<br />
de herhangi bir biyolojik örnekten elde edilen etiketli transkriptin varlığını <strong>ve</strong> miktarını belirlemede kullanılmak<br />
üzere tasarlanmış bir sistemdir. Mikrodizilim teknolojisi sayesinde binlerce farklı DNA molekülü katı bir yüzeye<br />
bağlanarak çok sayıda genin anlatımının analizi yüksek çözünürlükle <strong>ve</strong> eş zamanlı olarak gerçekleştirilebilmiştir.<br />
Ancak günümüzde mikrodizilim teknolojisinin maliyeti hala düşürülememektedir. Bu nedenle rutin çalışmalarda<br />
farklı teknolojilerin bir arada kullanıldığı yeni uygulamalar geliştirilmektedir.<br />
359
18.A<br />
Elisitörle Tetiklenebilen Sitokrom P450 Genlerinin<br />
Astragalus chrysochlorus’da Hedeflenmiş Farklılık<br />
Gösterimi (“Differential Display”, DD) ile İncelenmesi<br />
Neslihan TURGUT KARA<br />
Materyal<br />
Elisitör olarak maya özütü kullanılarak fenilpropanoid metabolizması uyarılmış Astragalus chrysochlorus bitkisine ait<br />
hücre süspansiyon kültürleri (Cakir <strong>ve</strong> Ari, 2009).<br />
Bu çalışmada ardışık olarak uygulanacak 8 yöntem ayrı başlıklar halinde <strong>ve</strong>rilmiştir.<br />
Hücre Süspansiyon Kültürlerinden Total RNA İzolasyonu<br />
Maya özütü uygulanmış hücre süspansiyon <strong>ve</strong> kontrol kültürlerinden total RNA izole edilir. RNA izolasyonu<br />
“One Step RNA Reagent” kullanılarak üreticinin önerdiği işlemlere göre aşağıdaki gibi yapılır.<br />
_ Bu uygulama kullanılacak izolasyon kitinde önerilen işlemlere göre farklılık gösterebilir.<br />
Gerekli Malzemeler<br />
“One Step RNA Reagent” (Bio Basic Inc., BS409)<br />
Dietil pirokarbonat (DEPC)<br />
_ RNA izolasyonunda RNaz etkisini engellemek üzere kullanılacak pipet uçları, mikro tüpler gibi plastik <strong>ve</strong> diğer<br />
malzemeler iki kez otoklavlanır. Çözeltilere RNaz engelleyicisi olan dietil pirokarbonat (DEPC) %0.1 oranında<br />
eklenir. DEPC’li çözeltiler bir gece bekletildikten sonra otoklavlanır.<br />
Kloroform<br />
İzopropil alkol<br />
%75 Etanol<br />
DEPC’li steril saf su<br />
Sıvı azot<br />
Yöntem<br />
1. Süspansiyon kültürlerinin süzülmesi ile elde edilen <strong>ve</strong> -70 o C’da saklanan hücre örnekleri soğuk havanda sıvı azot<br />
kullanılarak toz haline getirilir. Toz haline getirilen örnekler 100 mg hücre örneği başına 1 mL “One Step RNA<br />
Reagent” kullanılarak homojenize edilir.<br />
2. Homojenatlar, nükleoprotein komplekslerinin tamamen ayrılması için oda sıcaklığında 5 dakika bekletilir.<br />
Daha sonra her mL “One Step RNA Reagent” için 0.2 mL kloroform eklenir. Tüplerin kapakları parafilm ile sıkıca<br />
kapatıldıktan sonra 15 saniye elle ters düz edilir <strong>ve</strong> oda sıcaklığında 3 dakika bekletilir.<br />
3. Örnekler 4°C’da 12.000xg hızda 15 dakika santrifüjlenir. Santrifüjlemeden sonra karışım üç faza ayrılır: alt faz<br />
(fenol kloroform fazı), orta faz (beyaz ara faz) <strong>ve</strong> RNA’yı içeren sulu üst faz.<br />
4. RNA’yı içeren sulu üst faz yeni bir tüpe aktarılır. Sulu fazdaki RNA, izopropil alkol ile karıştırılarak çöktürülür. “One<br />
Step RNA Reagent”ın her mL’si için 0.5 mL izopropil alkol kullanılır. Örnekler oda sıcaklığında 10 dakika bekletilir.<br />
5. Daha sonra 4°C’da 12.000xg’de 10 dakika santrifüjlenir. RNA, tüpün dibinde jel görünümlü çökelti oluşturur.<br />
6. Çökelmiş RNA’yı içeren tüplerden üst sıvı atıldıktan sonra RNA çökeltisi %75’lik etanol ile bir kez yıkanır. Kullanılan<br />
her mL “One Step RNA Reagent” için 1 mL %75’lik etanol kullanılır.<br />
7. İşlemlerin sonunda, RNA çökeltisi tüplerin kapakları açık olacak şekilde oda sıcaklığında yaklaşık 15 dakika<br />
kurutulur.<br />
8. Kurutma işleminden sonra RNA üzerine DEPC’li steril saf su eklenir.<br />
371
18.B<br />
Patates Yumrusunda SAGE <strong>ve</strong>/<strong>ve</strong>ya long-SAGE<br />
Yöntemiyle Transkriptom Analizi<br />
Gülruh ALBAYRAK<br />
Gen anlatımının seri analiziyle çok sayıdaki transkript eş zamanlı olarak analiz edilebilmektedir. SAGE <strong>ve</strong> long-SAGE<br />
arasındaki fark, long-SAGE’de 14 bç yerine 21 bç boyutunda daha uzun dizi etiketlerinin oluşturulmasıdır. Her iki<br />
yaklaşımın çok sayıdaki ardışık uygulamayı gerektirmesi rutinde kullanımlarını güçleştirmektedir. Aşağıda Høgh <strong>ve</strong><br />
Nielsen (2008)’in patates yumrusundan gerçekleştirdikleri transkriptom analizine ait yöntem <strong>ve</strong>rilmiştir.<br />
Materyal<br />
Patates yumrusu<br />
Gerekli Malzemeler<br />
RNA Özütlemesi<br />
Sıvı azot<br />
DEPC’li (Dietilpirokarbonat) su<br />
_ 500 mL ultra saf suya 0.75 mL DEPC eklenir, iyice karıştırılır, bir gece bekletildikten sonra otoklavlanır.<br />
_ Oda sıcaklığında saklanır.<br />
Parçalama tamponu<br />
LiCl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100 mM<br />
Tris-HCl, pH 8.5 . . . . . . . . . . . . . 100 mM<br />
EDTA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10 mM<br />
SDS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .%1<br />
DTT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .15 mM<br />
_ DEPC’li suda çözdürülür<br />
Fenol, pH 4.5<br />
Kloroform: izoamilalkol (24:1)<br />
Fenol: Kloroform: İzoamilalkol (25:24:1)<br />
mRNA’nın Manyetik Boncuklara Bağlanması<br />
“Dynabead” oligo (dT) 25<br />
(Dynal biotech Asa, Nor<strong>ve</strong>ç)<br />
Lizis tamponu<br />
Tris-HCl, pH 7.5. . . . . . . . . . . . . .100 mM<br />
LiCl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 500 mM<br />
EDTA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10 mM<br />
Lityum dodesil sülfat . . . . . . . . . .%1<br />
DTT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5 mM<br />
Yıkama tamponu A<br />
Tris-HCl, pH 7.5. . . . . . . . . . . . . .10 mM<br />
LiCl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,15 M<br />
379
siRNA’lar ile Kültürdeki Hücrelerde<br />
Transkripsiyon Sonrası Gen Susturulması<br />
• • • •<br />
Duygu GEZEN AK, Erdinç DURSUN, Selma YILMAZER<br />
19<br />
19.1. RNA Engellemesi <strong>ve</strong> Küçük RNA’lar<br />
RNA engellemesi (müdahalesi) (“RNA interference”, RNAi) 20-30 nükleotidlik küçük, çift iplikli RNA’ların diziye<br />
özgü bir şekilde gen anlatımını susturmak için kullanılmasını kapsayan <strong>ve</strong> genelde transkripsiyon sonrasında<br />
(posttranskripsiyonel) iş gören bir mekanizmadır. RNAi’nin keşfi, gen anlatımı düzenlenmesinin anlaşılması<br />
konusunda adeta devrim yaratmıştır. Çift iplikli RNA’ların etkin bir şekilde genleri susturabileceği ilk kez bir nematod<br />
olan Caenorhabditis elegans’da ortaya çıkarılmıştır. Daha sonra Drosophila’da yapılan çalışmalar RNAi yolağının<br />
biyokimyasal bileşenlerinin anlaşılmasını sağlamıştır.<br />
Küçük RNA’lar gen susturma işlevini üç farklı yoldan yapabilirler. Bu yollar, (1) hedef mRNA’nın translasyonunu<br />
baskılamak, (2) hedef genin şifrelediği mRNA’nın parçalanmasını tetiklemek, (3) hedef gende kromatin değişimlerini<br />
tetikleyerek onun transkripsiyonunu engellemektir. Bu kısa RNA’lar özel enzimlerin etkinliğiyle daha uzun çift iplikli<br />
RNA öncüllerinden üretilirler <strong>ve</strong> gelişimin düzenlenmesinden viral enfeksiyonlara karşı organizmaların korunmasına<br />
kadar çeşitli işlevleri gerçekleştirirler.<br />
Sitoplazmadaki mRNA kopyalarını hedefleyerek gen anlatımını düzenleyen üç çeşit küçük RNA ailesi vardır. Bunlar<br />
mikro RNAlar (miRNA), küçük girişimci RNA’lar (siRNA) <strong>ve</strong> piwi ile etkileşen RNA’lardır (piRNA). Bunlardan miRNA’lar,<br />
hücrenin genleri tarafından şifrelenir <strong>ve</strong> saç tokası şeklindeki öncül RNA’lardan yapılırlar. siRNA’lar ise viral enfeksiyon<br />
<strong>ve</strong> diğer hücre dışı kaynaklardan köken alabilirler <strong>ve</strong> in vivo olarak daha uzun çift iplikli RNA öncüllerinden yapılırlar.<br />
piRNA’lar da hayvan germ serisi hücrelerdeki transpozon transkriptlerini hedef alırlar <strong>ve</strong> yıkılmasını sağlarlar.<br />
Bu küçük RNA’lar homolog hedef genlerin anlatımını baskılamak için söz konusu üç farklı yoldan hangisini kullanırsa<br />
kullansın, ortak bir mekanizmanın bileşenlerinin çoğunu kullanırlar. Bitkilerde <strong>ve</strong> hayvanlarda yaygın olarak kullanılan<br />
bu mekanizma, küçük RNA’ların bir protein kompleksi ile birleşerek hedef mRNA dizisine özgü bir gen susturucu<br />
ribonükleoprotein kompleksi oluşturmasını kapsar. Bu kompleks RNA’nın tetiklediği susturma kompleksi (“RNAinduced<br />
silencing complex”, RISC) adını alır. (siRNA <strong>ve</strong> miRNA’ların hücredeki oluşum süreçleri <strong>ve</strong> gerçekleştirdikleri<br />
reaksiyonların mekanizmalarının ayrıntısı için bkz. Bölüm 9).<br />
RNAi son yılların en heyecan <strong>ve</strong>rici keşiflerinden biridir. Bu mekanizma memeli gen işlevini araştırmada hızla en<br />
önemli yöntemlerden biri haline gelmiştir. Tedavi amaçlı olarak gen susturmanın geliştirilmesi yolunda da ümit vaat<br />
etmektedir.<br />
19.2. siRNA’lar ile Gen Susturulması<br />
RNAi mekanizmasının keşfedilmesi, hedeflenen genlerin siRNA’lar kullanılarak susturulması için yeni bir tekniğin<br />
geliştirilmesini sağlamıştır. RNAi ile gen susturmanın önemli bir özelliği de aşırı <strong>ve</strong>rimli oluşudur. Bu nedenle çok<br />
az miktarda siRNA çoğu zaman hedef genin yüksek oranda susturulmasını tetiklemek için yeterlidir. siRNA’lar<br />
yapay olarak da üretilirler <strong>ve</strong> istenilen herhangi bir hedef genin anlatımını baskılamak için güçlü bir deneysel araç<br />
391
20<br />
miRNA Anlatım Analizi <strong>Yöntemleri</strong><br />
• • • •<br />
Tuba GÜNEL<br />
mikroRNA’lar (miRNA’lar) hücre çoğalması, farklılaşması <strong>ve</strong> hücre döngüsü olaylarında düzenleyici rol oynayan hareketli,<br />
küçük <strong>ve</strong> yüksek derecede korunmuş RNA molekülleridir. Aktif olgun miRNA’lar, ökaryotik hücrelerde anlatımı yapılan<br />
17-24 baz çifti uzunluğundaki tek iplikli küçük RNA moleküllerinden oluşur. Tüm insan genlerinin üçte birinden fazlası<br />
miRNA molekülleri tarafından düzenlenir <strong>ve</strong> her miRNA birden fazla genin düzenlenmesinde etkili olabilir.<br />
miRNA anlatımının profillenmesi, doku farklılaşması sırasındaki düzenlenmenin <strong>ve</strong> onarım süreçlerinin<br />
aydınlatılmasına yardımcı olmaktadır. Bu nedenle, miRNA’lar doku kökeni bilinmeyen kanser türlerinde doku<br />
farklılaşma aşamasının belirlenmesi <strong>ve</strong>ya kök hücre uygulamalarında hücrenin yeniden programlanması gibi<br />
çalışmalarda biyobelirteç (“biomarker”) olarak kullanılmaktadır. miRNA anlatım analizi aynı zamanda gen anlatımı<br />
düzenlenmesini sistem düzeyinde araştırırken de yararlı olmaktadır. miRNA profili özellikle genom düzeyindeki<br />
diğer <strong>ve</strong>rilerle birlikte değerlendirildiğinde daha da doğru <strong>ve</strong> ayrıntılı bilgilerin elde edilmesine olanak <strong>ve</strong>rmektedir.<br />
miRNA’ların kan plazmasında <strong>ve</strong>ya serumda, idrarda, formalinle sabitlenmiş doku örneklerinde son derece iyi korunduğu<br />
<strong>ve</strong> proteinlerden çok daha duyarlı doğrulukla ölçülebildiği gösterilmiştir. Bu özellik miRNA’ların kanser, kardiyovasküler<br />
<strong>ve</strong> otoimmün hastalıklar dahil birçok hastalığın tanısında biyobelirteç olarak kullanılmasının yolunu açmıştır.<br />
Ancak, miRNA’lara özgü birçok özellik nicel <strong>ve</strong> nitel analizlerindeki kesinliği <strong>ve</strong> doğruluğu azaltabilmektedir. Örneğin,<br />
22 nükleotid uzunluğundaki olgun miRNA’lar qPCR için tasarlanmış olan primerlere bağlanmada yetersiz kalır. Buna<br />
ek olarak, mRNA’ların aksine, bağlanmayı kolaylaştıran poliA kuyruğunun bulunmaması toplam RNA kütlesi içinde<br />
yaklaşık %0.01’lik yer kaplayan miRNA’ların seçiminde zorluk yaratır. Aynı aile (örneğin, let-7 ailesi) içinde yer alan<br />
miRNA’lar arasında tek bir nükleotid fark bulunması da iki formun ayrımını güçleştirir. Aynı miRNA farklı biyolojik<br />
örneklerde farklı dizi uzunluklarında olabilir. Bazı durumlarda, olgun miRNA’nın 3’ ucuna transkripsiyon sonrasında<br />
nükleotid eklenmesiyle yeni miRNA çeşitleri (isomiR’ler) oluşabilir. Bunlar eksonükleolitik kesimin 3’ ucunda olduğu<br />
durumlarda standart miRNA’lardan daha kısa olurlar. 5’ ucundaki nükleotid eklenmesi <strong>ve</strong>ya çıkarılması daha az yaygın<br />
olmakla birlikte miRNA’nın işlevi üzerinde önemli etkilere sahiptir; çünkü bu değişimler merkezdeki diziyi (“seed<br />
region”, çekirdek bölgesi) değiştirebilir. Çekirdek bölgesi, miRNA’nın 5’ ucundaki 2-7 <strong>ve</strong>ya 2-8 pozisyonunda bulunan<br />
<strong>ve</strong> miRNA’nın hedef seçimini belirleyen altı <strong>ve</strong>ya yedi nükleotidlik dizidir. 3’ ucuna eklenen nükleotidler bu bölgeyi<br />
dizi anlamında değiştirmemesine karşın, miRNA’nın kararlılığını <strong>ve</strong> hedef seçimini etkileyebilir. miRNA genleri kısa<br />
dizi uzunluklarına rağmen GC içeriklerine bağlı olarak farklı erime derecelerine (T m<br />
) sahiptir. Bu da yüzlerce miRNA<br />
aynı anda paralel olarak analiz edilirken sorun yaratabilir.<br />
Tüm bu zorluklara rağmen miRNA analizi için kullanılan üç yaklaşım da [qPCR, melezleme temelli yöntemler (örneğin,<br />
mikrodizilim) <strong>ve</strong> RNA dizileme] başarılı şekilde uygulanmaktadır. miRNA dizilerine “miRBase Sequence Database”<br />
linkinden ulaşılabilir. Bundan sonraki adım farklı dokular, gelişim evreleri ya da hastalık durumlarında miRNA anlatım<br />
düzeylerinin analizidir. miRNA anlatım düzeyleri çeşitli yöntemlerle belirlenebilir: Mikrodizilim (bkz. Bölüm 22),<br />
gerçek zamanlı PCR (qPCR) (bkz. Bölüm 21), Northern damgalama (bkz. 12.4), in situ melezleme (bkz. Bölüm 13).<br />
395
21<br />
Gerçek Zamanlı Polimeraz<br />
Zincir Reaksiyonu (qPCR) ile<br />
Gen Anlatımının Analizi<br />
• • • •<br />
Filiz GÜREL<br />
Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu ya da diğer adıyla kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR)<br />
başta gen anlatımının belirlenmesi <strong>ve</strong> patojenlerin tanısı olmak üzere çeşitli DNA analizlerinde kullanılan duyarlı<br />
<strong>ve</strong> güçlü bir yöntemdir. <strong>Temel</strong>inde PCR’ye dayanan bu yöntem floresan teknolojisindeki ilerlemelere bağlı olarak<br />
1990’lı yıllarda geliştirilmiştir. Bu yöntemde oluştukları andan itibaren PCR ürünlerindeki artış, DNA’ya bağlanan<br />
floresan boyalar sayesinde izlenebilmekte <strong>ve</strong> eşzamanlı olarak ölçülebilmektedir. Ek olarak, oluşan ürünler yüksek<br />
sıcaklığa <strong>ve</strong> devamında erimeye bırakılarak uzunlukları <strong>ve</strong> nükleotid içeriklerine bağlı olarak daha ayrıntılı bir şekilde<br />
tanımlanabilmektedir. Bu son uygulama günümüzde tek nokta polimorfizmlerinin duyarlı şekilde saptanmasına<br />
olanak <strong>ve</strong>rir. Bu özellikleriyle qPCR moleküler biyoloji araştırmalarında gen analizlerinin <strong>ve</strong> klinik mikrobiyolojide<br />
tanının kalitesini artırmıştır.<br />
PCR’nin gerçek zamanlı olarak (anında) izlenebilmesi ilk kez 1992’de Roche <strong>Moleküler</strong> Sistemler şirketinden Russell<br />
Higuchi <strong>ve</strong> grubu tarafından başarılmıştır. Bu çalışmada PCR’nin her döngüsünde DNA’ya bağlanan etidyum<br />
bromürün yaydığı floresandaki artış bir video kamera ile saptanmıştır. Zaman içerisinde, oluşan ürün miktarının<br />
doğrudan ölçülebilmesine olanak <strong>ve</strong>ren aletler tasarlanmıştır. Günümüzde qPCR için boyut olarak küçülmüş, çok<br />
sayıda örnekle çalışılabilen <strong>ve</strong> analiz süreleri kısalmış aletler bulunmaktadır.<br />
Gerçek zamanlı PCR’nin klasik PCR <strong>ve</strong> gen anlatımı analizlerinde kullanılan diğer yöntemlere göre oldukça önemli<br />
avantajları vardır. Hedef bölgenin çoğaltımı <strong>ve</strong> kantitasyonu aynı alette yapılabilmekte, böylece elektroforez aşaması<br />
ortadan kalkmaktadır. Bu da çok örnekli çalışmalarda zaman tasarrufu sağladığı gibi bulaşma (kontaminasyon)<br />
tehlikesini de azaltmaktadır. Nükleik asit özütlemesi gibi ön aşamaların tamamen otomatik hale gelmesiyle birlikte,<br />
qPCR’ye dayalı tanı <strong>ve</strong> analizlerin süresi son derece kısalmıştır.<br />
Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonunun en fazla kullanıldığı çalışma alanı hiç şüphesiz gen anlatımının<br />
analizidir. Canlılığın devamı, bölünme <strong>ve</strong> farklılaşma gibi birçok hücresel süreç gen anlatımının değişmesiyle<br />
gerçekleştiğinden, özel genlerin transkripsiyon düzeylerinin nicel olarak ortaya konulabilmesi genin işlevine<br />
ilişkin çok önemli bilgiler sunar. qPCR ile hücrede bir gene ait hedeflenen mRNA’nın miktarı yüksek duyarlılıkta<br />
belirlenebilir. Transkripsiyon ürünü RNA miktarının belirlenmesinde kullanılan diğer başlıca yöntemler Northern<br />
damgalama (blotlama) (bkz. 12.4), RNaz koruma belirlemesi <strong>ve</strong> geri transkripsiyon PCR’si (bkz. 16.5.3) olmuştur.<br />
Northern damgalamanın en büyük zorluğu mRNA’nın hücrelerden çok az miktarda elde edilebilmesidir. PCR’ye<br />
dayalı bir yöntem olan qPCR ise bu moleküllerin dolaylı çoğaltımını sağlayarak hem bu zorluğun aşılmasını hem<br />
399
21.A<br />
Gerçek Zamanlı PCR ile Maternal Kanda Fetal RhD<br />
Geninin Tanımlanması<br />
Tuba GÜNEL<br />
1940 yılında, Rhesus maymunlarına karşı oluşturulan tavşan serumunun, insan serum örneklerinin büyük<br />
kısmının çökmesine neden olduğu bulunmuş <strong>ve</strong> bu seruma Rh faktörü adı <strong>ve</strong>rilmiştir. Rh sistemine ait antijenler 1.<br />
kromozomun kısa kolunda RHD <strong>ve</strong> RHCE olmak üzere iki gen grubu tarafından şifrelenir. D(+) bireyler RHD geninin<br />
bir <strong>ve</strong>ya iki kopyasına sahipken, D(-) bireyler bu gene sahip değildir (Cherif-Zahar <strong>ve</strong> ark., 1991). Lo <strong>ve</strong> ark. (1998) fetal<br />
RhD dizisinin gerçek zamanlı PCR (qPCR) teknolojisi kullanılarak gebeliğin ilk üç ayında <strong>ve</strong>ya 1. trimesterde maternal<br />
plazmadan yüksek duyarlılıkta <strong>ve</strong> özgül olarak gü<strong>ve</strong>nilir bir şekilde elde edilebileceğini göstermişlerdir. Fetal Rh<br />
geninin girişimsel olmayan (“non-invasi<strong>ve</strong>”) biçimde maternal kandan izolasyonu başarıldıktan sonra annenin kan<br />
dolaşımından hücre dışı serbest fetal DNA izolasyonu ile fetusun RhD durumu belirlenerek girişimsel (“invasi<strong>ve</strong>”) bir<br />
prenatal tanı yöntemi kullanılmaksızın RhD uyuşmazlığı olabilecek gebelerin belirlenmesi olası hale gelmiştir.<br />
Materyal<br />
Gebelerden vakumlu tüp yardımıyla önkol toplardamarından yaklaşık 5 mL periferik kan örneği EDTA’lı tüp içerisine<br />
alınır. Tüpe alınan kan örnekleri 5.000 devir/dakika hızda 15 dakika santrifüjlenir <strong>ve</strong> elde edilen plazma 15 mL’lik tüpe<br />
aktarılır. Plazma bu tüp içinde DNA izolasyonu işlemine dek korunmak üzere -80°C’da saklanabilir.<br />
Gerekli Malzemeler<br />
“TaqMan Uni<strong>ve</strong>rsal PCR Master mix”<br />
TagMan probu 5’-(FAM) AGC AGC ACA ATG TAG ATG ATC TCT CCA (TAMRA)-3’<br />
<strong>İleri</strong> primer 5’ – CTC CAT CAT GGG CTA CAA – 3’<br />
Geri primer 5’ – CCG GCT CCG ACG GTA TC – 3’<br />
Yöntem<br />
1. EDTA’lı tüpe alınan 5 mL anne kanından serbest fetal DNA izolasyonu yapılır (bkz. Bölüm 5).<br />
2. RhD geninin tayini için bu genin ekson 7 bölgesine özel primerler <strong>ve</strong> TagMan probu kullanılarak Tablo 1’deki<br />
içerikle <strong>ve</strong> Tablo 2’deki koşullarda qPCR hazırlığı yapılır. Pozitif kontrol için RhD geni içeren, negatif kontrol için<br />
Rh negatif olduğu bilinen <strong>ve</strong> bulaşma tayini için DNA içermeyen PCR (NTC) reaksiyon karışımlarını içeren tüpler<br />
hazırlanır.<br />
Tablo 1. qPCR bileşenlerinin derişimleri <strong>ve</strong> kullanılan hacimler<br />
Bileşenler Hacim (µL) Derişim<br />
TagMan Probu 0.6 25 nM<br />
<strong>İleri</strong> Primer 3 300 nM<br />
Geri Primer 3 300 nM<br />
dH₂O 13.4 —<br />
Kalıp DNA 5 20 ng<br />
Master Mix 25 —<br />
423
21.B<br />
Schizosaccharomyces pombe’de aft1 Geninin Göreceli<br />
Anlatım Analizi<br />
Bedia PALABIYIK<br />
Çalışmada SBYR Green temeline dayalı gerçek zamanlı PCR (qPCR) yöntemi uygulanarak hedef genin (atf1) referans<br />
gene (aktin proteinini şifreleyen act1) göre göreceli anlatım düzeyleri incelenmiştir (“relati<strong>ve</strong> quantification”). Buna<br />
göre uygulama, kontrol (YT_K) <strong>ve</strong> deney (YT_D) grupları olmak üzere iki örnek üzerinde kurgulanmıştır.<br />
Materyal<br />
Schizosaccharomyces pombe, yabani tip (972h - )<br />
Gerekli Malzeme <strong>ve</strong> Donanım<br />
Stratagene Mx-Pro-Mx3005P qPCR sistemi<br />
“SYBR Green PCR Master Mix” (Roche)<br />
Özgül ileri <strong>ve</strong> geri primerler (Araştırıcı tarafından tasarlanır)<br />
96-kuyucuklu tabla<br />
Tablayı örten yapışkanlı şeffaf kap<br />
Buz bloğu (Bütün çözelti <strong>ve</strong> örnekleri soğuk tutmak için)<br />
Yöntem<br />
Örnek Hazırlama<br />
Çalışmada kullanılacak RNA örneklerinin kalitesi analizin gü<strong>ve</strong>nilirliği bakımından çok önemlidir. Her örnek üç<br />
tekrarlı olmalıdır. Bu tekrarlar programın <strong>ve</strong>ri analizi için gereklidir.<br />
1. Hedef <strong>ve</strong> referans genlere ait primerlerin tasarımı “Primer3” programı kullanılarak tasarlanır (Tablo 1).<br />
Tablo 1. Çalışmada kullanılan primerler<br />
Gen adı Primerin adı Primer dizileri<br />
atf1<br />
atf1L (ileri) 5´-ACCCCTACTGGAGCTGGATT-3´<br />
atf1R (geri) 5´-ACCATCCCTTGGGGTAAAAC-3´<br />
act1<br />
act1L (ileri) 5´-AGATTCTCATGGAGCGTGGT-3´<br />
act1R (geri) 5´-TCAAAGTCCAAAGCGACGTA-3´<br />
2. Her primer serisi için kaç reaksiyonun yapılacağı hesaplanır. Tablo 2’de <strong>ve</strong>rilen reaksiyon programı uygulanır.<br />
Tablo 2. Deney tablasının düzenlenmesi.<br />
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11* 12*<br />
A S1<br />
1<br />
act1<br />
S2<br />
5<br />
act1<br />
S3<br />
25<br />
act1<br />
S4<br />
125<br />
act1<br />
YT_K<br />
act1<br />
YT_K<br />
act1<br />
YT_K<br />
act1<br />
YT_K<br />
atf1<br />
YT_K<br />
atf1<br />
YT_K<br />
atf1<br />
B S1<br />
1<br />
S2<br />
5<br />
S3<br />
25<br />
S4<br />
125<br />
YT_D<br />
act1<br />
YT_D<br />
act1<br />
YT_D<br />
act1<br />
YT_D<br />
atf1<br />
YT_D<br />
atf1<br />
YT_D<br />
atf1<br />
C<br />
S1<br />
1<br />
S2<br />
5<br />
S3<br />
25<br />
S4<br />
125<br />
NTC<br />
act1<br />
NTC<br />
act1<br />
NTC<br />
act1<br />
D<br />
E<br />
F<br />
G<br />
H<br />
* Kullanılan tabla 96 kuyucuklu olduğundan tasarlanan deneyde bu kuyucuklar boştur.<br />
NTC<br />
atf1<br />
NTC<br />
atf1<br />
NTC<br />
atf1<br />
425
21.C<br />
Sybr Green I Boya <strong>Temel</strong>li Gerçek Zamanlı PCR ile<br />
Fusarium graminearum tri5 Geninin Anlatım Analizi<br />
Emre YÖRÜK, Gülruh ALBAYRAK<br />
Gerçek zamanlı PCR (qPCR), sadece nitel <strong>ve</strong>ri eldesine olanak tanıyan standart geri transkripsiyon PCR’sinden farklı<br />
olarak gen anlatımının hem nicel hem de nitel olarak analiz edilebilmesini sağlar. Bu yaklaşımla hedef örneklerdeki<br />
nükleik asit miktarları pikogram düzeyinde saptanabilmekte, genlere ait kopya sayıları belirlenebilmekte <strong>ve</strong><br />
geliştirilmiş ticari ürünler kullanılarak yaklaşık 380 örneğin gen anlatım profilleri eş zamanlı olarak incelenebilmektedir.<br />
Buna karşın, gerçek zamanlı PCR analizi mikrodizin gibi karmaşık bir sistemle karşılaştırıldığında örnekleme sayısı<br />
bakımından oldukça sınırlı kalmaktadır. Ek olarak geniş çaplı transkriptom <strong>ve</strong>ya genom taramaları için de uzun bir<br />
süreci gerektirmektedir. Yine de gerçek zamanlı PCR, yüksek maliyetli <strong>ve</strong> aynı zamanda çip geliştirme zorunluluğu<br />
olan mikrodizin analizlerine göre günümüzde hala tercih edilerek sıklıkla etkin bir şekilde kullanılmaktadır.<br />
Çalışmada bir fitopatojen olan Fusarium graminearum’da trikotesen B sınıfı mikotoksinlerin üretiminden sorumlu tri5<br />
gen kümesinde yer alan tri5 geninin anlatımı β-tubulin temel (“housekeeping”) geninin anlatımı ile karşılaştırılarak<br />
araştırılmıştır. Bu amaçla öncelikli olarak total RNA molekülleri 7 günlük in vitro mantar kültürlerinden trizol (Roche,<br />
İsviçre) ile izole edilir, saflık <strong>ve</strong> miktarları kontrol edilen RNA moleküllerinden cDNA sentezi ticari kit (Roche, İsviçre)<br />
kullanılarak gerçekleştirildikten sonra gerçek zamanlı PCR analizi yapılır.<br />
Materyal<br />
%15 gliserolde saklanmış Fusarium graminearum stok kültürü.<br />
Gerekli Malzemeler<br />
Kültür Başlatma<br />
Patates dekstroz agar besiyeri<br />
Patates özütü. . . . . . . . . . . . . . .4 g/L<br />
Dekstroz . . . . . . . . . . . . . . . . . .20 g/L<br />
Agar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 g/L<br />
RNA İzolasyonu<br />
Tripure ajanı: Fenol <strong>ve</strong> guanidin tiyosiyanatın monofazik bileşeni (Roche, İsviçre)<br />
Sıvı azot<br />
Kloroform<br />
İzopropanol<br />
%0.1’lik dietilpirokarbonatlı (DEPC’li) su<br />
%0.1’lik DEPC’li su ile hazırlanmış %70 etanol<br />
cDNA Sentezi<br />
Total RNA molekülü (DEPC’li su içinde son derişimi 200 ng/µL olacak şekilde çözündürülmüş)<br />
Rastgele heksamer (Rastgele altılı nükleotid dizilerine sahip 600 µM’lük oligonükleotid karışımı, Roche, İsviçre)<br />
_ Oligo dT 18<br />
primeri <strong>ve</strong>ya özgün diziye sahip oligonükleotid primerler de cDNA sentezinde kullanılabilir.<br />
429
21.D<br />
HeLa Hücre Kültüründe Oksidatif Stres ile Oluşturulan<br />
DNA Hasarının qPCR ile Belirlenmesi<br />
Özlem EROL TINAZTEPE<br />
Gerçek zamanlı PCR ya da kantitatif PCR (qPCR) analizi, hedef dizideki DNA hasarlarının DNA polimerazın iş<br />
görmesini engelleyerek, PCR sonucu oluşacak ürün miktarını düşürmesi temeline dayanır (bkz. Bölüm 21). qPCR ile<br />
hem nükleus hem de mitokondri DNA’sındaki hasarlar belirlenebilir. Ürün miktarındaki azalmayı belirleyebilmek için<br />
her bir DNA örneğinden eşit miktarda kullanmak <strong>ve</strong> reaksiyonu ürün miktarının üssel artış gösterdiği evre içindeki<br />
bir döngüde (Şekil 1 <strong>ve</strong> Şekil 2) sonlandırmak gerekir (Grimaldi <strong>ve</strong> ark., 2002). Kalıp DNA miktarının fazla olması üssel<br />
evreden çıkılmasına <strong>ve</strong> yanlış sonuçların elde edilmesine neden olabilir. Kalıp miktarına göre PCR ürünlerindeki lineer<br />
azalmayı görmek <strong>ve</strong> reaksiyonun işleyişini kontrol edebilmek için her bir reaksiyonda bütün kalıplar için DNA’ların<br />
normale göre yarısının (50 ng) kalıp olarak kullanıldığı birer reaksiyonun da yapılması önerilir (Yakes <strong>ve</strong> van Houten,<br />
1997). qPCR analizi için DNA izole edilirken DNA’da ek hasarlara sebep olmayacak, yüksek molekül ağırlığına sahip<br />
total genomik DNA izolasyonuna izin <strong>ve</strong>ren kitler (Örneğin, GenElute Memeli <strong>Genomik</strong> DNA İzolasyon Kiti, Sigma)<br />
kullanılır.<br />
HeLa Hücre Kültüründe Oksidatif Stres Oluşturulması<br />
Materyal<br />
HeLa hücreleri<br />
(%5 CO 2<br />
sağlayan etüvde, 37 o C’da üretilir <strong>ve</strong> 3 günde bir alt kültürleme işlemi yapılır.)<br />
Gerekli Malzemeler<br />
PBS (Dulbecco’nun Fosfat Tamponu)<br />
H 2<br />
O 2<br />
750 mM<br />
Tripsin-EDTA<br />
%0.2 Tripsin<br />
%0.04 EDTA<br />
6 kuyucuklu kültür kapları<br />
Hemositometre<br />
15 mL’lik steril plastik tüpler<br />
Besiyeri<br />
Streptomisin (0.1 mg/mL), penisilin (100 ünite/mL), amfoterisin (0.25 µg/mL), %10 fetal sığır serumu (FBS) içeren<br />
MEM (“Minimum Essential Medium”) (pH 7.4).<br />
Yöntem<br />
1. Yeni bir kültür kabında alt kültürleme yapılmadan önce hücreler bir hemositometre yardımıyla sayılır <strong>ve</strong> 6<br />
kuyucuklu kültür kabının her bir kuyucuğunda 5 mL (10 5 hücre/mL) olacak şekilde yeni bir kültür kabına aktarılır.<br />
2. Alt kültürü yapılan hücreler etüvde (37 o C, %5 CO 2<br />
) 72 saat inkübe edildikten sonra besiyeri uzaklaştırılır <strong>ve</strong><br />
hücreler PBS ile yıkanır.<br />
3. Hücreler PBS ile sulandırımı yapılan 750 mM H 2<br />
O 2<br />
’in 5 mL’si ile 60 dakika inkübe edilerek oksidatif stres oluşturulur.<br />
4. İnkübasyon sonunda hücreler PBS ile yıkanır.<br />
5. Üzerine 150 mL tripsin-EDTA çözeltisi eklenmiş hücreler etüvde (37 o C, %5 CO 2<br />
) 15 dakika inkübe edilir.<br />
6. İnkübasyon sonunda tripsin enziminin aktivitesini yok etmek için 5 mL besiyeri eklenir <strong>ve</strong> hücre süspansiyonu<br />
steril tüpe aktarılır.<br />
435
22<br />
Mikrodizilim Teknolojisi<br />
• • • •<br />
Ayşegül TOPAL SARIKAYA, Tuba GÜNEL<br />
Mikrodizilim (“Microarray”) teknolojisi tek bir deneyle DNA/RNA <strong>ve</strong>ya proteinlerin diğer moleküllerle kurdukları<br />
özgül etkileşimlerin genom/transkriptom <strong>ve</strong>ya proteom düzeyinde belirlenmesine olanak <strong>ve</strong>ren en güncel<br />
teknolojilerden biridir. Bu teknolojide prob olarak kullanılacak molekülün (DNA <strong>ve</strong>ya protein) katı bir yüzey<br />
(cam, naylon membran, plastik <strong>ve</strong>ya silikon) üzerine mikroskobik boyutta <strong>ve</strong> sıralı spotlar (noktalar) şeklinde<br />
baskılanmasıyla oluşturulmuş mikroçipler kullanılır. Mikroçipleri hazır olarak satın almak <strong>ve</strong>ya çalışmaya özgü olarak<br />
üretmek mümkündür.<br />
DNA mikrodiziliminin temeli bir DNA ipliğinin tamamlayıcı özellikteki bir nükleik asit (DNA <strong>ve</strong>/ya RNA) ipliğine<br />
yüksek bir ilgiyle bağlanma özelliğine dayanır. Protein mikrodiziliminde ise protein-protein, protein-lipit, protein-<br />
DNA, protein-peptid, protein-ilaç, enzim-substrat, antijen-antikor vb. etkileşimlerden yararlanılır. Bir çip üzerinde<br />
yer alan prob sayısı yüzbinlere kadar ulaştığından baskılama için özel robotlara, melezlemenin <strong>ve</strong>ya etkileşimin<br />
sonucunu görüntülemek için gelişmiş görüntüleme sistemlerine, sonuçların analizi için özel yazılımlara gereksinim<br />
vardır. Görüntüleme örnekteki işaretin (etiketin) tipine göre farklı yöntemlerle (örneğin, florometrik, kolorimetrik,<br />
radyoaktif) gerçekleştirilir. Yüksek duyarlılık, hızlı okunma, kolay <strong>ve</strong> gü<strong>ve</strong>nli uygulama gibi özelliklerinden dolayı<br />
floresan etiketler yaygın kullanım alanı bulmaktadır.<br />
Mikrodizilimler çipte kullanılan katı yüzeyin <strong>ve</strong> probun (oligonükleotid, cDNA, genomik DNA <strong>ve</strong>ya protein) tipine<br />
<strong>ve</strong>ya kullanılma amacına (gen anlatımı, mutasyon analizleri, kromozom analizleri) ya da probun yüzey üzerine<br />
baskılanma biçimine (“robotic spotting”, in situ melezleme) göre çeşitli şekillerde sınıflandırılmaktadır. Kullanılan prob<br />
temelde iki farklı molekül tipinden biri olacağı için bu bölümde önce mikrodizilim tipleri DNA mikrodizilimleri <strong>ve</strong><br />
protein mikrodizilimleri olmak üzere iki ana sınıfta incelenmiş, ardından laboratuvarda mikroçip üretimine ilişkin<br />
bilgiler aktarılmıştır.<br />
22.1. DNA Mikrodizilimleri<br />
DNA mikrodizilimlerinde kullanılan çipler katı yüzey olarak genellikle camın kullanıldığı, olabildiğince çok sayıda<br />
(400.000 kadar) mikroskobik odacıkta belirli miktarda DNA probun baskılandığı çiplerdir. Hedef molekül olarak<br />
genellikle cDNA’nın kullanıldığı DNA mikrodizilimleri çeşitli koşullar altında, hastalıklarda <strong>ve</strong> farklılaşma sırasında<br />
anlatımı değişen genlerin aynı anda belirlenmesine <strong>ve</strong> aradaki farkın saptanmasına olanak sağlar (Şekil 22.1).<br />
441
22.A Serbest Fetal DNA’da Trizomi21 Tanısı için aCGH<br />
Tuba GÜNEL<br />
Günümüzde genetik <strong>ve</strong> genomik bilgilerin teknoloji ile birleşmesi gebelik sürecine önemli katkı sağlamıştır. Anne<br />
kanından fetüse ait DNA’yı girişimsel olmayan (“non-invasi<strong>ve</strong>”) yöntemlerle izole etme çalışmalarının başarılı olması,<br />
fetüse ait hücre dışı DNA (“cell-free fetal DNA”, cff-DNA) biyolojisi ile ilgili temel bilgilere ulaşılmasını sağlamıştır. Son<br />
yıllarda bu konuda tüm dünyada <strong>ve</strong> ülkemizde çok hızlı bir ilerleme kaydedilmiştir.<br />
Trizomi21’li (Down sendromlu) fetüslerin doğum öncesi saptanması dünyadaki tüm tarama programlarının<br />
önemli bir hedefidir. cff-DNA örneklerinde karşılaştırmalı genomik melezleme mikrodizilimi (aCGH) (bkz. 22.1.1)<br />
ile Down sendromu taraması, günümüzde klinikte kullanılan serum tarama algoritmaları ile karşılaştırıldığında<br />
daha özgül <strong>ve</strong> duyarlıdır. Girişimsel yöntemlerde söz konusu olan düşük riskini içermez. Gebeliğin 10. haftasında<br />
uygulanabilmesinden dolayı erken <strong>ve</strong> hızlı sonuç <strong>ve</strong>rme avantajıyla da komplikasyonlu gebeliklerde önlem alma<br />
şansını artırır.<br />
Materyal<br />
9-11. gebelik haftaları arasındaki gebeden alınan 5 mL toplardamara ait (<strong>ve</strong>nöz) kan örneğinden elde edilen kan<br />
plazması<br />
Gerekli Malzemeler<br />
Rastgele primer (“random primer) (Agilent Technologies)<br />
“SureTag Complete” DNA İşaretleme Kiti (Agilent Technologies)<br />
1xTE Tamponu, pH 8.0 (Promega)<br />
Saflaştırma kiti (Agilent Technologies)<br />
Melezleme odacıkları-lastikli slaytlar (Agilent Technologies)<br />
SurePrint G3 Custom CGH Array 4x180K çipi (Agilent Technologies)<br />
“Oligo aCGH/ChIP-on-chip” yıkama tamponu 1 (Agilent Technologies)<br />
“Oligo aCGH/ChIP-on-chip” yıkama tamponu 2 (Agilent Technologies)<br />
“Oligo aCGH/ChIP-on-chip” melezleme kiti (Agilent Technologies)<br />
Asetonitril (%100)<br />
“Agilent CytoGenomics” yazılım lisansı<br />
Yöntem<br />
_ Çalışma sırasında herhangi bir bulaşmayı engellemek için çok temiz bir alanda çalışılmalı, pudrasız eldi<strong>ve</strong>n<br />
kullanılmalıdır. Stok çözeltilere fazla dondurma/çözündürme yapılmamalıdır.<br />
1. Isıtıcı bloklar ya da su banyoları 95, 37 <strong>ve</strong> 65 o C’a ayarlanır.<br />
_ İsteğe bağlı olarak ısıtma işlemleri için PCR aletinden yararlanılabilir.<br />
2. Örnekler 6000xg hızda 1 dakika santrifüjlenerek tüpün duvarlarında ya da kapağında kalmış çözeltiler dibe<br />
indirilir.<br />
3. Her bir tüpe 13 µL örnek <strong>ve</strong> 2.5 µL rastgele primer (”random primer”) konulur. Pipet yarımıyla karıştırılır <strong>ve</strong><br />
santrifüjde en yüksek hızda birkaç saniye çevrilir.<br />
455
23<br />
Genetik Çeşitlilik (Varyasyon)<br />
<strong>Analizler</strong>i<br />
• • • •<br />
Nermin GÖZÜKIRMIZI<br />
Organizmalar <strong>ve</strong> türler arasındaki farklılıklar çeşitlilik (varyasyon) olarak tanımlanır. Genetik çeşitlilik populasyonda<br />
başlıca mutasyon <strong>ve</strong> rekombinasyon temelli olabilir. Bu olaylar kalıtsal madde değişimleridir. Son yıllarda kalıtım<br />
maddesinde bir değişim olmaksızın gen anlatımında oluşan değişimlerin (epigenetik değişimler) de çeşitliliğin çok<br />
önemli bir kısmını oluşturduğu bilinmektedir. Epigenetik konusu ayrı bir bölümde (bkz. Bölüm 24) ele alındığından bu<br />
bölümde özellikle genetik temelli değişimlerin tanımlanması konusu üzerinde durulacaktır. Genetik araştırmaların<br />
temeli normal <strong>ve</strong> farklı olanı karşılaştırmaya dayandığından genetik çeşitlilik analizleri genetikçiler için çok önemlidir.<br />
Çeşitlilik genler içerisinde oluştuğunda alleller <strong>ve</strong> haplotipler, bireyler arasında oluştuğunda kişisel heterozigotluk,<br />
bir populasyonda oluştuğunda allel frekansları, ortalama heterozigotluk, ortalama polimorfik allel <strong>ve</strong> lokus oranı vb.<br />
kavramlar, populasyonlar arasında oluştuğunda da farklılaşma <strong>ve</strong> genetik uzaklıklar vb. kavramlar söz konusudur.<br />
23.1. Genetik Çeşitlilik (Varyasyon) Mekanizmaları<br />
Mutasyon bir organizmanın kalıtım maddesini oluşturan nükleotidlerin sayı, sıra <strong>ve</strong> çeşidinde oluşan önceden<br />
programlanmamış değişimlerdir. Rekombinasyon ise var olan kalıtım materyalinin yeni bir düzenlenme göstermesidir.<br />
Ökaryotik organizmalarda bu yeni düzenlenmelerin başlıca kaynakları mayoz bölünme sırasındaki krossing-o<strong>ve</strong>r <strong>ve</strong><br />
metafaz I’deki bağımsız dizilimdir. Ayrıca, somatik hücrelerde de somatik rekombinasyonlara rastlanmaktadır. Örneğin<br />
immünoglobin genlerinin çeşitlenmesi gibi. Genetik maddeki olası değişimler Tablo 23.1’de <strong>ve</strong>rilmiştir.<br />
Tablo 23.1. Genetik çeşitliliğe yol açan olaylar.<br />
Nükleotid<br />
Tez baz değişimleri<br />
• Nokta mutasyonları (1/800 bp)<br />
Küçük insersiyon/delesyonları<br />
• Çerçe<strong>ve</strong> kayması, mikrosatelit, minisatellit<br />
Hareketli elementler<br />
• Retroelement insersiyonları (300 bp - 10 kb)<br />
Büyük düzeyde genomik kopya sayısı varyasyonları (>10 kb)<br />
• Büyük delesyonlar<br />
• Segmental duplikasyonlar<br />
Lokal düzenlenmeler<br />
Kromozomal varyasyonlar<br />
• Translokasyon, in<strong>ve</strong>rsiyon, füzyon<br />
Kopya sayısı varyasyonları<br />
Yapısal varyasyonlar<br />
Sitogenetik<br />
459
24<br />
Epigenetik <strong>Analizler</strong><br />
• • • •<br />
Nermin GÖZÜKIRMIZI<br />
İlk olarak, 1950’lerde Conrad Waddington tarafından önerilen epigenetik terimi günümüzde, gen anlatımında<br />
DNA dizisindeki değişimlerle açıklanamayan <strong>ve</strong> mitoz <strong>ve</strong>/<strong>ve</strong>ya mayoz bölünmeyle kalıtılabilen değişiklikler olarak<br />
tanımlanmaktadır. DNA metillenmesi, DNA değişimleri (modifikasyonları), genomik damgalanma (“imprinting”),<br />
transgen sessizleşmesi, histon değişimleri (asetillenme, metillenme, ubikitinlenme, fosforillenme vb.), X kromozomu<br />
aktivitesinin yok olması, şifreleme yapmayan RNA’larla mRNA anlatımının kontrol edilmesi ile PcG (“polycomb”) <strong>ve</strong><br />
TrxG (“trithorax”) grubu proteinler tarafından yönlendirilen <strong>ve</strong> kromatinin sessiz kalmasına yol açan bir epigenetik<br />
bellek sistemi olan kromatin değişimleri başlıca epigenetik olaylardır.<br />
Epigenetik, terim olarak klasik genetiğin dışında demektir. Epigenetik değişimler eski haline dönüştürülebilir <strong>ve</strong><br />
sonraki kuşaklara aktarılabilir. Ancak; bu değişimlerin hücre bölünmesi sırasında yavru hücreye nasıl aktarıldığı tam<br />
olarak anlaşılamamakla birlikte, kalıtılan epigenetik değişimlerin kromatin durumlarıyla taşındığı düşünülmektedir.<br />
Aynı şekilde, bu bilginin, organizmalarda, sonraki kuşaklara nasıl aktarıldığı da pek anlaşılamamıştır.<br />
Epigenetik değişimleri başlatan <strong>ve</strong> devam ettiren üç ayrı <strong>ve</strong> birbiriyle örtüşen mekanizma tanımlanmıştır: siRNA’lar,<br />
histon değişimleri <strong>ve</strong> DNA metillenmesi. Bu işlemler transkripsiyon ürünü RNA’ların kararlığını, DNA katlanmasını,<br />
nükleozom yerleşimini, kromatin sıkıştırılmasını <strong>ve</strong> nükleus organizasyonunu etkiler. Tek tek <strong>ve</strong>ya birleşerek bir<br />
genin sessizleşmesine ya da anlatım yapmasına neden olurlar. Bunun sonucunda hastalıklara yatkınlık, içsel <strong>ve</strong>ya<br />
dışsal çevresel etmenlerin tetiklediği epigenetik değişimler ile genetik bilginin karmaşık etkileşimleri sonucunda<br />
ortaya çıkar. Daha önceki araştırmalarda DNA düzeyindeki mutasyonlar, delesyonlar, gen birleşmeleri, ardışık<br />
ikilenmeler (duplikasyonlar) <strong>ve</strong> gen çoğaltımlarının (amplifikasyonlarının), herhangi bir hastalığa yatkınlıkta <strong>ve</strong>ya<br />
hastalık genlerinde anlatımın bozulmasında ana etkin mekanizmalar olduğu belirlenmiştir. Ancak, günümüzde<br />
gen anlatımlarının epigenetik olarak değişmesinin de hastalık gelişiminde aynı oranda etkili olduğu anlaşılmıştır.<br />
Epigenetik mekanizmalar Tablo 24.1’de toplu halde gösterilmiştir.<br />
24.1. DNA Değişimleri<br />
İntronlara, tekrarlanan elementlere <strong>ve</strong> aktif olarak yer değiştiren dizilere sahip şifreleme yapmayan DNA’nın uzun<br />
süreli sessizleştirilmesi için etkili mekanizmalar gereklidir. Memeliler bunun için sitozin metillenmesini kullanır. Sitozin<br />
metillenmesi, S-adenozil-L-metiyonini metil <strong>ve</strong>ricisi olarak kullanan metiltransferazlar tarafından gerçekleştirilir<br />
(Şekil 24.1). Genler metillenmemiş promotörler yardımıyla, anlatımı yapılan <strong>ve</strong> yapılmayan komşu bölgelerin<br />
metillenmiş olmasına rağmen anlatım yapabilir. Başka bir deyişle şifreleme yapmayan bölgeler baskılanmış halde<br />
iken gen promotörleri kullanılıp düzenlenebilir. Metillenme aynı zamanda X’e bağlı <strong>ve</strong> damgalanmış halde bulunan<br />
genlerin de uzun süreli sessizleştirilmesinde kullanılır.<br />
465
PROTEİNLERİN İZOLASYON<br />
<strong>ve</strong> ANALİZİ
25<br />
Proteinlerin İzolasyonu<br />
• • • •<br />
Nazlı ARDA, Haluk ERTAN<br />
Doğadaki en önemli makromolekül gruplarından biri de proteinlerdir. Hücrede pek çok işlev binlerce farklı tipte<br />
protein molekülü tarafından yürütülür. Örneğin enzimler biyolojik katalizde, membran proteinleri <strong>ve</strong> reseptörler<br />
hücresel madde iletimi <strong>ve</strong> algılamada, antikorlar, çeşitli tipte zehir <strong>ve</strong> antibiyotikler savunmada, büyüme faktörleri<br />
gelişmede, aktin, miyosin <strong>ve</strong> flagellin gibi proteinler harekette <strong>ve</strong> polipeptid hormonlar haberleşmede görev alırlar.<br />
Bu büyük çeşitliliğe <strong>ve</strong> farklı işlevlere karşın temelde oldukça benzer yapıları olan bu moleküllerin, üstlendikleri<br />
önemli görevler nedeniyle yapılarının aydınlatılması, sentezlerinin, işlevlerinin <strong>ve</strong> düzenlenme mekanizmalarının<br />
ortaya konulması çok büyük önem taşır. Nicel <strong>ve</strong> nitel protein analizleri metabolizmanın işleyişi hakkında önemli<br />
ipuçları sağladığından, canlı ile ilişkili tüm temel bilim dallarında, biyoteknolojide <strong>ve</strong> tıpta büyük yer tutar. Özellikle<br />
rekombinant DNA teknolojisinin ürünü olarak elde edilen proteinlerin izolasyonu <strong>ve</strong> tanımlanması moleküler<br />
biyolojik araştırmaların en temel işlemleri arasında yer almaktadır.<br />
Bir <strong>ve</strong>ya daha fazla sayıda polipeptid zincirinden meydana gelen proteinler, doğada genellikle diğer moleküllerle<br />
beraber bir molekül havuzunda <strong>ve</strong> çoğunlukla da bu moleküllerle yapısal <strong>ve</strong> işlevsel bir birliktelik içinde bulunurlar.<br />
Ancak böyle bir ortamda bir proteinin yapısını <strong>ve</strong> işlevini doğru bir şekilde tanımlayabilmek çok zordur. Yapı-işlevdüzenlenme<br />
ile ilgili araştırmalarda <strong>ve</strong> bazı aktivite belirleme çalışmalarında yapısı tanımlanmış saf proteinlere<br />
gereksinim vardır. Ayrıca terapötik proteinler çok yüksek saflıkta olmalı, bazı endüstriyel üretim süreçlerinde ileri<br />
derecede saflaştırılmış proteinler kullanılmalıdır.<br />
Bir proteinin nasıl izole edileceğine, hangi yöntemle <strong>ve</strong> ne derece saflaştırılacağına <strong>ve</strong>ya analiz edileceğine karar<br />
<strong>ve</strong>rmeden önce, amaç, materyalin <strong>ve</strong> çalışılacak proteinin tipi <strong>ve</strong> miktarı, işlemlerin süresi <strong>ve</strong> maliyeti, eldeki olanaklar<br />
vb. ölçütler göz önünde bulundurulmalıdır.<br />
25.1. Alet, Malzeme <strong>ve</strong> Kimyasal Maddeler<br />
Protein izolasyonu <strong>ve</strong> saflaştırılması geniş çapta alet kullanımı gerektirir. Son yıllarda bu alanlarda kaydedilen<br />
gelişmeler, yöntemlerin temelindeki gelişmelerden çok, kullanılan aletlerin hız, etkinlik, duyarlılık vb. özelliklerindeki<br />
ilerlemelerden kaynaklanmaktadır. Diğer biyokimyasal yöntemlerde olduğu gibi, proteinlerle ilgili çalışmalarda<br />
da terazi, pH-metre, manyetik karıştırıcı <strong>ve</strong> buz makinesi gibi temel laboratuvar donanımlarından geniş çapta<br />
yararlanılmakta, ayrıca daha özel bazı aletlere de gereksinim duyulmaktadır. Bunlar arasında çeşitli tipte<br />
homojenizatörler, santrifüjler, kromatografi sistemleri, çeşitli tipte elektroforez aletleri, jel görüntüleme aletleri,<br />
spektrofotometre, liyofilizatör, amino asit analizörü, sintilasyon sayıcısı vb. sayılabilir (bkz. Bölüm 1). Protein<br />
araştırmaları sırasında belli bir eşgüdüm içinde kullanılan bütün bu aletlere ek olarak 10-5.000 µL sıvı ölçebilen ayarlı<br />
mikropipetler <strong>ve</strong> 10-50 µL’lik Hamilton şırıngalar çalışmalarda çok büyük kolaylık sağlar.<br />
475
25.A<br />
Protein A <strong>ve</strong>ya Protein G Bağlı Sefaroz Boncuklarla<br />
İmmün Çöktürme<br />
Cenk KIĞ<br />
İmmün çöktürme bir proteinin bulunduğu ortamdan ayrılarak ileri düzeyde saflaştırılmasına olanak <strong>ve</strong>ren bir<br />
yöntemdir. Antikor-antijen ilişkilerinin çeşitliliği, tanı <strong>ve</strong> tedavi gibi klinik uygulamaların yanı sıra moleküler biyoloji<br />
alanındaki çalışmalarda da çok geniş kullanım alanları yaratmıştır. Özellikle rekombinant DNA teknolojisinin<br />
kullanımıyla antikorlar <strong>ve</strong>ya antikorların belli bölgeleri değiştirilerek çok daha geniş bir çeşitlilik elde edilmiş,<br />
maliyet düşürülmüş <strong>ve</strong> ilgili deneysel yöntemler çok daha kolaylaştırılmıştır. Staphylococcus aureus’daki protein<br />
A <strong>ve</strong> Streptococcus türlerindeki protein G özellikle IgG sınıfı immünoglobulinlere (antikorların ağır zincirine)<br />
yüksek afinite ile bağlanabilen bakteri kökenli proteinlerdir. Bu proteinlerin, boncuk şekline getirilmiş çapraz<br />
bağlı agarozlardan<br />
25-1.<br />
oluşan<br />
Protein<br />
katı bir<br />
A <strong>ve</strong>ya<br />
destek<br />
Protein<br />
materyaline<br />
G Bağlı<br />
[örneğin,<br />
Sefaroz Boncuklarla<br />
sefaroz (Sepharose®)<br />
İmmün Çöktürme<br />
boncuklara] bağlanmasıyla<br />
herhangi bir antikorun özgül olarak etkileştiği proteini <strong>ve</strong>ya yapıyı boncuklarla beraber ayırarak saflaştırmak<br />
mümkün olmaktadır Cenk (Şekil KIĞ 1).<br />
Protein-A<br />
Antikor (ağır zincir)<br />
Özgün<br />
antikor<br />
Sefaroz<br />
Hedef<br />
Protein A-bağlı<br />
boncuk<br />
protein<br />
sefaroz boncukla<br />
immün çöktürme<br />
Sekil Şekil 1. Protein 1. A A bağlı sefaroz boncuklarla immün çöktürmenin şematik şematik gösterimi. gösterimi.<br />
Örneğin hücrelerden belli bir proteinin çöktürülmesi amaçlanıyorsa basitçe, hedef proteine özgü antikor ile hücre<br />
özütü karıştırılarak inkübasyona bırakılır. Daha sonra, protein A <strong>ve</strong>ya protein G bağlı sefaroz boncuklar karışıma<br />
eklenir <strong>ve</strong> bir süre sonra boncuklar santrifüjlemeyle ayrılarak yıkanır. Alternatif olarak, önce antikorla protein A <strong>ve</strong>ya<br />
protein G bağlı sefaroz boncuklar inkübasyona bırakılıp antikorla bağlandıktan sonra, boncuklar santrifüjlemeyle<br />
ayrılıp yıkanarak hücre özütüne de eklenebilir. Bu aşamadan sonra boncuklar, biyokimyasal testlerde <strong>ve</strong>ya üzerine<br />
doğrudan örnek yükleme tamponu eklenip kaynatılarak SDS-PAGE (bkz. 1.2.8 <strong>ve</strong> 28.2) <strong>ve</strong> Western damgalamada<br />
(bkz. 28.6) kullanılabilir. Ayrıca, boncuklar bir kolona yüklenip uygun tamponlarla yıkanarak hedef proteinin<br />
boncuklardan ayrılması da sağlanabilir.<br />
Bu yöntem, özellikle protein etkileşimlerinin araştırılmasında oldukça yaygın şekilde kullanılmaktadır. Eğer hedef<br />
proteinle etkileşime giren bir protein varsa, immün çöktürme sonrasında Western damgalama ile (etkileştiği<br />
düşünülen antikorlar kullanılarak) bu ilişki kolaylıkla test edilebilir [birlikte çöktürme (“coimmunoprecipitation”),<br />
CO-IP yöntemi), bkz. 1.2.16]. Fiziksel etkileşime giren proteinlerden herhangi biri burada açıklanan immün<br />
çöktürme tekniği ile çöktürüldüğünde, teorik olarak bu proteine kuv<strong>ve</strong>tle bağlanan diğer protein(ler) de (etkileşim<br />
ortakları) birlikte çöker. Ancak, immün çöktürme yapıldıktan sonra boncuklar yükleme tamponuyla kaynatılıp SDSpoliakrilamid<br />
jel elektroforezi uygulaması yapıldığında denatüre edici koşullarda boncukta bağlı bulunan tüm<br />
Şekil 2. FLAG işaretli MELK proteini anlatımı yapılan HEK293 hücre kültüründen hazırlanan lizatlarda (h<br />
immün çöktürme sonrasında örneklerin western analizi. Jellere yaklaşık 50 μg protein içeren örnek yük<br />
proteinler birbirinden ayrılır. Örneğin, X ile Y proteini etkileşiyorsa, X proteini için immün çöktürme uygulandıktan<br />
uygulandıktan sonra ayrılan proteinler naylon membrana aktarılır. Aktarım sonrasında membranlar blok<br />
sonra bu örnek Western damgalama ile analiz edildiğinde hem X hem de Y antikorlarıyla sinyal elde edilir. Y proteini<br />
5 yağsız süt tozu, PBS (1x), % 0,1 Tween-20) bloklandıktan sonra (4°C’da 1 saat) FLAG-işaretine özgül an<br />
de X ile birlikte çöktüğünden bu durum birlikte çökme olarak tanımlanabilir.<br />
bırakılır (4°C’da 1 gece). Bantların yaklaşık boyutlarının saptanması amacıyla jelin bir kuyucuğuna da pro<br />
belirteçleri (M) uygulanır.<br />
495
26<br />
Proteinlerin Nicel Analizi<br />
• • • •<br />
Nazlı ARDA, Haluk ERTAN<br />
Bir çözeltideki protein derişiminin (belli hacimdeki toplam protein miktarının) bilinmesi, ayırma <strong>ve</strong> saflaştırma<br />
işlemlerinin seçiminde <strong>ve</strong> belli aşamalarda protein <strong>ve</strong>riminin/saflığının kontrolünde önemli bir yer tutar. Özellikle<br />
elektroforetik (bkz. Bölüm 28, 34, 35) <strong>ve</strong> kromatografik (bkz. Bölüm 29, 36) ayrımlarda deneylerin optimizasyonu için<br />
miktar tayinine gereksinim duyulur. Ayrıca çalışılan bir enzimin spesifik (özgül) aktivitesi <strong>ve</strong> saflaştırma derecesinin<br />
belirlenmesinde (bkz. Bölüm 30) de toplam protein miktarının bilinmesi şarttır.<br />
Protein derişiminin belirlenmesi için doğrudan <strong>ve</strong>ya dolaylı birçok yöntem geliştirilmiştir. Bunlar arasında, azot<br />
miktarının belirlenmesine dayalı <strong>ve</strong> dolaylı bir yöntem olan Kjeldahl yöntemi ile kızılötesi spektrofotometri, türbidimetri,<br />
florimetri, refraktometri <strong>ve</strong> polarografi gibi doğrudan yöntemler sayılabilir. Primer yapısı bilinen bir proteinin amino<br />
asit analizi yardımıyla da miktar tayinini yapmak olasıdır. Ancak triptofan, sistin <strong>ve</strong> sistein gibi asidik hidrolize çok<br />
duyarlı bazı amino asitlere ait <strong>ve</strong>riler gü<strong>ve</strong>nilir değildir. Ayrıca glutamin <strong>ve</strong> asparagin, hidrolizden sonra asit forma<br />
dönüştüklerinden bunlarla ilgili de yanlış sonuçlar alınabilir.<br />
Son yıllarda yararlanılan teknikler, protein çözeltisinin UV absorbsiyonunun (soğurumunun) ölçülmesi <strong>ve</strong>ya bir<br />
belirteç ile reaksiyon sonucunda oluşan renkli bir bileşiğin (kromofor) görünür alanda spektrofotometrik olarak<br />
belirlenmesi temeline dayanır. Burada <strong>ve</strong>rilecek yöntemlerden ilkinde, çalışılan çözeltinin UV absorbsiyonu<br />
doğrudan ölçülür <strong>ve</strong> protein derişimi hesap yoluyla bulunur. Diğer üçünde ise çeşitli belirteçlerle işlem sonucu<br />
oluşan renkli bileşiğin absorbansı belirlenir <strong>ve</strong> derişimleri bilinen standart protein çözeltilerinin ortaya koyduğu<br />
<strong>ve</strong>rilerle karşılaştırılır. Bazı spektrofotometrik yöntemlerde renk gelişimi, ilgili proteinin amino asit içeriği ile yakından<br />
ilişkilidir <strong>ve</strong> protein olmayan prostetik gruplardan (örneğin, karbohidratlardan) da etkilenebilir. Bu nedenle standart<br />
protein olarak yaygın bir şekilde kullanılan sığır serum albümini (“bovine serum albumin”, BSA) ile tam doğru sonuç<br />
alınamayabilir. Gü<strong>ve</strong>nilir <strong>ve</strong>riler elde etmek için kullanılan standart protein, olabildiğince saf <strong>ve</strong> çalışılan proteinle<br />
özdeş (hatta aynı biyolojik materyalden izole edilmiş) ya da çok benzer olmalıdır.<br />
26.1. A 280<br />
/A 260<br />
Oranının Belirlenmesi (Warburg-Christian Yöntemi)<br />
Tirozindeki fenolik gruplar <strong>ve</strong> triptofandaki indolik gruplar nedeniyle birçok protein 280 nm’de maksimum<br />
absorbsiyon gösterir. Bu özellikten yararlanılarak örnekteki protein miktarının yaklaşık olarak bulunması için hızlı bir<br />
yöntem geliştirilmiştir. Çok duyarlı olmamakla beraber (duyarlılık: 0.05-2.0 mg/mL) kolaylığı <strong>ve</strong> hızlı sonuç <strong>ve</strong>rmesi<br />
nedeniyle çok kullanılan bir tekniktir. Ancak, 260 nm’de maksimum absorbsiyon gösteren nükleik asitlerin 280 nm’de<br />
de absorbsiyon yetenekleri olduğu unutulmamalıdır. Bu nedenle nükleik asit artıkları ile bulaşmış durumdaki ilk<br />
ham özütlerle çalışıldığında hatalı sonuçlar elde edilebilir. Bunun önüne geçmek için, Warburg <strong>ve</strong> Christian (1941)<br />
tarafından geliştirilmiş bir seri hata düzeltme faktörü (Tablo 26.1) kullanılır. Protein çözeltisinin saflık derecesi<br />
yükseldikçe hatalar da en aza indirgendiğinden, bu yöntem daha çok yarı saf <strong>ve</strong>ya saf protein çözeltilerine uygulanır.<br />
503
27<br />
ELISA<br />
• • • •<br />
Ali KARAGÖZ<br />
Bir örnekteki antijen <strong>ve</strong>ya antikorun ya da diğer analitlerin (GDO’lar, çeşitli alerjenler, pestisidler, herbisidler, özellikle<br />
besinlerdeki ilaç kalıntıları) varlığını belirlemek için yaygın olarak kullanılan biyokimyasal tekniklerden biri kısa adıyla<br />
ELISA (“Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay”) ya da diğer adıyla EIA (“Enzyme Immuno Assay”)’dır. ELISA mevcut<br />
antijen <strong>ve</strong>ya antikor miktarının özgül olarak belirlenmesi amacıyla kullanılan basit <strong>ve</strong> duyarlı bir yöntemdir. Bu<br />
yöntem günümüzde özellikle bilimsel araştırmalar, sağlık, <strong>ve</strong>terinerlik, çevre <strong>ve</strong> tarımsal uygulamalarda rutin olarak<br />
kullanılmaktadır. ELISA yöntemi hedef antijenin (analitin) immün sistem tarafından üretilen antikorlar tarafından<br />
yüksek özgüllükte tanınması temeline dayanır. ELISA yöntemi geleneksel RIA (“RadioImmunoAssay”) yöntemine<br />
dayanarak geliştirilmiştir. RIA’da radyoizotoplar kullanılırken ELISA’da enzimle işaretli (enzim-bağlı) antikorlar<br />
kullanılır. <strong>Temel</strong> anlamda bir ELISA’da, antijen katı bir yüzeye bağlanır <strong>ve</strong> daha sonra bir enzime bağlı olan bir<br />
antikorla kompleks haline getirilir. İşlem, antikora bağlı enzimin ölçülebilir bir ürün (genellikle renk) oluşturmak<br />
üzere kromojen bir substratla işleme sokulması <strong>ve</strong> sonucun değerlendirilmesiyle tamamlanır.<br />
ELISA uygulamaları çok sayıda (genellikle 96 bazen 384) mikrokuyucuklu polistren kaplarda (“microplate”)<br />
gerçekleştirilir. ELISA’da kullanılacak olan belirleyici enzim, ya doğrudan primer (birincil) antikora ya da primer<br />
antikoru tanıyabilen sekonder (ikincil) antikora bağlanabilir. Bu amaçla ELISA’da en yaygın olarak kullanılan<br />
enzimler; yabanturpu peroksidazı (“horseradish peroxidase”, HRP) <strong>ve</strong> alkalin fosfataz (“alkaline phosphatase”, AP)<br />
enzimleridir. Bunların dışında başka enzimler de (β-galaktozidaz, asetilkolin esteraz <strong>ve</strong> katalaz) kullanılmakla birlikte<br />
sınırlı substrat seçenekleri nedeniyle fazla tercih edilmezler. Bununla birlikte HRP <strong>ve</strong>ya AP enzimleri için çok fazla<br />
substrat seçeneği mevcuttur. Substrat seçimi yöntemin duyarlılığına <strong>ve</strong> mevcut ölçüm cihazlarının kapasitesine<br />
(spektrofotometre, florometre, lüminometre) bağlıdır. ELISA’da belli bir antijene özgül olan en azından bir antikor<br />
kullanımına ihtiyaç vardır.<br />
Basit bir ifadeyle, ELISA’da bilinmeyen miktardaki antijen katı bir yüzeye (genellikle polistren mikrokuyucuklara) ya<br />
adsorpsiyonla özgül olmayan bir şekilde ya da aynı antijene özgü başka bir antikorla bağlanarak özgül bir şekilde<br />
tutturulur. Antijen yüzeye tutunduktan sonra bu antijene özgül olarak bağlanabilen bir antikorla işleme sokulur.<br />
Antijene bağlanan bu belirleyici antikora aynı zamanda bir enzim kovalent bir şekilde bağlıdır <strong>ve</strong> yöntemin son<br />
aşamasında enzim tarafından ölçülebilir bir sinyale (genellikle kimyasal bir substratta renk değişimi) dönüşebilen<br />
bir substrat eklenir. Her aşamada ELISA kapları özgül olarak bağlanmayan herhangi bir protein <strong>ve</strong>ya antikoru<br />
uzaklaştırmak için uygun çözeltilerle yıkanmalıdır. Son yıkama aşamasından sonra ELISA kabına, örnekteki antijenin<br />
(<strong>ve</strong>ya antikorun) sayısal değerini gösteren görülebilir bir sinyal oluşturmak amacıyla enzimatik bir substrat eklenir.<br />
Sonuçta ortaya çıkan değişim (örneğin renk değişimi) çeşitli ölçüm cihazları (örneğin spektrofotometre) ile<br />
değerlendirilerek sayısal olarak ortaya konulur.<br />
Genel ELISA uygulamalarında antijenin, çok kuyucuklu kapların kuyucuk yüzeylerine doğrudan adsorpsiyonla <strong>ve</strong>ya<br />
bu yüzeylere önceden tutturulmuş antikorlara bağlanarak tutunması sağlanır. Daha sonra bu antijenin belirlenmesi<br />
enzim bağlı bir primer antikorun kullanılmasıyla (doğrudan belirleme) <strong>ve</strong>ya birbiriyle uyumlu (antijeni tanıyan)<br />
513
BÖLÜM 7: Proteinlerin ‹zolasyonu, Analizi <strong>ve</strong> Saflaflt›r›lmas› • 193<br />
28<br />
7.6.5.4. Polietilen Glikol (PEG) ile Çöktürme<br />
Polietilen glikol (PEG) iyonik olmayan <strong>ve</strong> suda çözünebilen bir polimerdir. % 20-30<br />
PEG konsantrasyonunda maksimum protein çökmesi gerçekleflir.<br />
1) 100 ml’lik bir protein çözeltisine sürekli kar›flt›r›larak <strong>ve</strong> yavafl yavafl 150 ml’lik<br />
% 50 (w/v) PEG-6.000 eklenir.<br />
Tek Boyutlu Protein Elektroforezi <strong>ve</strong><br />
Protein tamponda çözündürülür. Saptama <strong>Yöntemleri</strong><br />
2) 30-60 dakika sonra oluflan çökelti di¤er ifllemlerde oldu¤u gibi santrifüjlenir <strong>ve</strong><br />
➠ PEG saflaflt›rma aflamalar›nda herhangi bir sorun yaratmamakla beraber, istenirse,<br />
ultrafiltrasyon ile çözeltiden uzaklaflt›r›labilir.<br />
• • • •<br />
Nazlı ARDA, Evren ÖNAY UÇAR, Haluk ERTAN<br />
7.7. Protein Elektroforezi<br />
Yüklü moleküllerin elektriksel alanda ayr›lmalar› temeline dayanan elektroforez tekni¤i<br />
(bkz. Bölüm 1.2.8) proteinlerin analizinde <strong>ve</strong> ayr›lmas›nda da genifl çapta kullan›l›r.<br />
Yüklü moleküllerin elektriksel alanda ayrılmaları temeline dayanan elektroforez tekniği (bkz. 1.2.8) proteinlerin<br />
<strong>Temel</strong>de protein tan›mlama (molekül a¤›rl›¤›n›, oligemerik mi, monomerik mi oldu¤unu,<br />
analizinde <strong>ve</strong> saflaştırılmasında geniş çapta kullanılır. <strong>Temel</strong>de proteini tanımlamak (molekül ağırlığını, alt birim<br />
sayısını, miktar›n›, miktarını, safl›¤›n› saflığını vb. belirlemek belirlemek) vb) <strong>ve</strong> <strong>ve</strong> ayırmak saflaflt›rma amacıyla amac›yla kullanılan kullan›lan bu yöntem bu doğal yöntem <strong>ve</strong>ya do¤al rekombinant <strong>ve</strong>ya bir<br />
proteinin rekombinant sentezlenip sentezlenmediği; bir proteinin sentezlenip sentezleniyorsa sentezlenmedi¤i; işlevsel olup olmadığı sentezleniyorsa hakkında da bilgi ifllevsel <strong>ve</strong>rir. olup<br />
Proteinler olmad›¤› izoelektrik hakk›nda noktalarının da bilgi (pl) <strong>ve</strong>rir. üzerindeki pH değerlerinde (-) yüklüdürler <strong>ve</strong> elektriksel alanda anoda göç<br />
ederler; izoelektrik noktalarının altındaki pH değerlerinde ise (+) yüklüdürler <strong>ve</strong> katoda göç ederler.<br />
Proteinler izoelektrik noktalar›n›n (pI) üzerindeki pH de¤erlerinde (–) yüklüdürler <strong>ve</strong><br />
Proteinlerin elektroforetik ayrımında nişasta, agaroz <strong>ve</strong> selüloz asetat gibi çeşitli jeller kullanılmakla birlikte, genelde<br />
elektriksel alanda anoda göç ederler; izoelektrik noktan›n alt›ndaki pH de¤erlerinde ise (+)<br />
en iyi ayrışımın sağlandığı poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) tekniği uygulanır. PAGE’de destek matrisi olan<br />
poliakrilamid, yüklüdürler akrilamid <strong>ve</strong> katoda monomerlerinin göç ederler. çapraz bağlayıcı (“cross-linker”) moleküller (N,N’-metilen-bis-akrilamid,<br />
kısaca bis) Proteinlerin yardımıyla kovalent elektroforetik olarak bağlanmasından ayr›m›nda niflasta, oluşan agaroz bir polimerdir <strong>ve</strong> selüloz (Şekil 28.1). asetat gibi çeflitli jeller<br />
Çapraz kullan›lmakla bağlayıcı olmadan birlikte, da akrilamid genelde polimerize en iyi ayr›fl›m›n olabilir, ancak sa¤land›¤› oluşan poliakrilamid viskoz çözeltinin jel kullanımı elektroforezi pratik olarak<br />
mümkün<br />
(PAGE)<br />
değildir.<br />
tekni¤i<br />
Çapraz bağlayıcının<br />
uygulan›r.<br />
eklenmesiyle<br />
PAGE’de destek<br />
jelde polipeptidlerin<br />
matrisi olan<br />
geçeceği<br />
poliakrilamid,<br />
porlar oluşur.<br />
akrilamid<br />
Polimerizasyon<br />
ya kimyasal, ya da fotokimyasal yolla gerçekleştirilir. Polimerizasyon başlatıcı olarak, kimyasal yöntemde amonyum<br />
monomerlerinin çapraz ba¤lay›c› (“cross-linker”) moleküller (N,N’-metilen-bis-akrilamid,<br />
persülfat, fotokimyasal yöntemde ise riboflavin kullanılır. Bu iki polimerizasyon başlatıcının birlikte kullanıldığı<br />
uygulamalar k›saca da bis) vardır. yard›m›yla N,N,N’,N’-tetrametilenetilendiamin kovalent olarak ba¤lanmas›ndan (TEMED) oluflan iki uygulamada bir polimerdir da katalizör (fiekil işlevi 7.6). görür.<br />
Fotokimyasal Çapraz polimerizasyonda ba¤lay›c› olmadan jel karışımı da floresan akrilamid ışık altında polimerize tutulur. olabilir, Jelde düşük ancak iyonik oluflan kuv<strong>ve</strong>t isteniyorsa viskoz <strong>ve</strong><br />
çalışılan protein amonyum persülfata ya da kimyasal polimerizasyonla oluşan yan ürünlere duyarlı ise, çok az<br />
miktarda riboflavinin kullanıldığı bu yöntem tercih edilir.<br />
CH 2 = CHCONH 2 + CH 2 (NHCOCH–CH 2 ) 2<br />
Akrilamid<br />
N,N'-metilen N,N’-metilen bisakrilamid bisakriliamid (bis)<br />
(monomer)<br />
(çapraz bağlayıcı)<br />
SERBEST RAD‹KAL KATAL‹ZÖR<br />
(TEMED)<br />
POL‹MER‹ZASYON<br />
–CH 2 –CH–[CH 2 –CH–]–CH 2 –CH–<br />
–<br />
CO CO CO<br />
NH NH 2 NH<br />
CH 2 CH 2<br />
NH NH 2 NH<br />
CO CO CO<br />
–CH 2 –CH–[CH 2 –CH–]–CH 2 –CH–<br />
–<br />
–<br />
–<br />
–<br />
–<br />
–<br />
–<br />
–<br />
–<br />
n<br />
n<br />
Poliakrilamid<br />
(polimer)<br />
Poliakrilamid<br />
(polimer)<br />
–<br />
–<br />
–<br />
–<br />
–<br />
–<br />
fiekil Şekil 7.6. 28.1. Akrilamidin Akrilamidin polimerizasyonu.<br />
523
29<br />
Proteinlerin Kromatografik Ayrımı<br />
<strong>ve</strong> Saflaştırılması<br />
• • • •<br />
Nazlı ARDA, Haluk ERTAN<br />
Proteinlerin kromatografik olarak ayrılması <strong>ve</strong> saflaştırılması amacıyla birçok yöntem <strong>ve</strong> araç geliştirilmiştir.<br />
Kullanılacak kromatografi yöntemine karar <strong>ve</strong>rmeden önce, genelde iki farklı yaklaşımdan biriyle ön ayırma işlemi<br />
uygulanır. Bunlardan ilkinde, ham özütlerde proteinler dışındaki moleküller <strong>ve</strong> yapılar tek tek uzaklaştırılır. Örneğin,<br />
ham özüte streptomisin sülfat eklenerek DNA molekülleri çöktürülür <strong>ve</strong> santrifüjleme ile ortamdan uzaklaştırılır.<br />
İkinci yaklaşımda ise, önce çözünebilir proteinlerin tümü çöktürme yöntemiyle karışımdan ayrılır, daha sonra da<br />
istenen protein saflaştırılır.<br />
Proteinler büyüklük <strong>ve</strong> şekil, toplam yük, yüzeyde bulunan hidrofobik gruplar, kullanılan durağan faz ile bağlanma<br />
kapasitesi gibi farklı özelliklere sahip olduklarından, bu karakteristik özelliklerden biri temel alınarak gerçekleştirilen<br />
kromatografik yöntemlerle (bkz. 1.2.7) saflaştırılabilirler. Bu yöntemlerden en çok uygulananı kolon kromatografisidir.<br />
Kolon kromatografisi, kolon dolgu maddesi (durağan faz) - katı <strong>ve</strong>ya yüksek viskoziteli bir madde (matriks,<br />
resin, reçine, jel) - ile doldurulmuş, alttan musluklu basit bir cam boruda gerçekleştirilebilir (Şekil 29.1a, bkz. Şekil<br />
1.18). Protein karışımı uygun bir yıkama (elüsyon) çözeltisi yardımıyla kolondan geçirilir. Kolon dolgu maddesiyle<br />
(a)<br />
(b)<br />
Sinterli disk<br />
Protein karışımı<br />
Yüzeyin bloke olması<br />
Küçük boşluk<br />
I II III IV V<br />
Şekil 29.1. (a) Kolon dolgu maddesinin kolona doğru bir şekilde doldurulması. Kolonun her bölgesinde eşit büyüklükte<br />
(ya da özellikte) dolgu maddesinin bulunabilmesi için, sıvı içindeki dolgu maddesi sürekli karıştırılarak dökülür. (b)<br />
Kolona örnek uygularken karşılaşılan bazı durumlar. (I) Akış tüm yüzeye uygun şekilde yayılmış: ideal durum. (II) Sinterli<br />
diskin kenarındaki bir boşluktan daha fazla akış olduğundan tutucu (adsorban) yüzey bozulmuş. (III) Lastik tıpanın<br />
ortasındaki borudan akan damlalar, tutucu yüzeyin çok yakın olması nedeniyle, yüzeyde bir boşluk oluşmasına <strong>ve</strong><br />
kolonun merkezinde aşırı akışa yol açmış. (IV) III’deki sorun yüzey üzerindeki tampon (yıkama sıvısı) miktarı artırılarak<br />
giderilmiş. (V) Örnekteki partiküllü materyal tutucu yüzeyi bozmuş <strong>ve</strong> akış yolu bozulmuş. Bu durumu önlemek için,<br />
örnek, uygulanmadan önce santrifüjleme <strong>ve</strong>ya filtrasyon ile partiküllerden arındırılmalıdır.<br />
571
30<br />
Enzimatik Analiz <strong>ve</strong> Aktivite<br />
Belirleme <strong>Yöntemleri</strong><br />
• • • •<br />
Haluk ERTAN, Nazlı ARDA<br />
Enzimler, biyolojik katalizör olmaları nedeniyle dünyamızdaki yaşamı olası kılan etmenlerin başında gelir. Bu açıdan<br />
enzimoloji, moleküler biyolojinin en önemli alt çalışma alanlarından birisini oluşturur. Enzimlerin varlıklarını,<br />
etkinliklerini, hücrede bulundukları yeri, kataliz mekanizmalarını, miktarlarını, saflıklarını vb. özelliklerini belirlemenin<br />
en etkin yolu onların aktivitelerini ölçmektir. Şu ana kadar binlerce enzimin varlığı saptanmış <strong>ve</strong> bunlara ilişkin<br />
aktivite belirleme yöntemleri geliştirilmiştir. Herhangi bir enzim için ideal bir aktivite belirleme yolu yoktur, çünkü bir<br />
yöntemin uygunluğu bazı faktörlere bağlıdır. Bunların başında, enzimin saflığı, fizikokimyasal özellikleri, katalizlediği<br />
reaksiyonun tipi, yerleşim yeri, ölçüm yönteminin maliyeti, eldeki mevcut ölçüm aletlerinin niteliği, ölçümün<br />
duyarlılığı ile ilgili zorunluluklar vb. gelir.<br />
30.1. Enzimatik Analizin <strong>Temel</strong> İlkeleri<br />
Bir enzimin aktivitesini ölçmek için araştırmacının belirli bir zaman aralığı içinde, enzimin kataliz etkinliği sonucu<br />
oluşan değişimi saptaması gerekir. Bu değişimin <strong>ve</strong> onun hızının belirlenmesi enzim aktivitesi olgusunun temelini<br />
oluşturur. Bu açıdan enzim aktivitesinin belirlenmesi temel olarak kinetik bir ölçümdür. Ölçümde zamana göre<br />
değişen parametre, kataliz sonucu reaksiyon ortamındaki ürünün oluşum <strong>ve</strong>ya substratın kullanım hızıdır (Şekil<br />
30.1). Şekilde de izlenebileceği gibi, reaksiyonun başlarında değişim doğrusal (lineer) bir şekilde ilerlerken,<br />
reaksiyonun sonlarına doğru substratın tükenmesine bağlı olarak ürün oluşumunda bir azalma görülür <strong>ve</strong><br />
doğrusallık kaybolur.<br />
Ürün<br />
Zaman<br />
Şekil 30.1. Enzimatik bir reaksiyonda ürünün oluşum hızı.<br />
591
31<br />
Oksidatif Protein Hasarlarının<br />
Belirlenmesi<br />
• • • •<br />
Nazlı ARDA, Murat PEKMEZ<br />
Protein oksidasyonu, bir proteinin doğrudan reaktif oksijen türleri (ROT’lar) tarafından <strong>ve</strong>ya dolaylı olarak oksidatif<br />
stresin yan ürünleri tarafından kovalent değişime (modifikasyona) uğratılması olarak tanımlanır. ROT’ların en temel<br />
içsel kaynakları mitokondrilerdeki elektron sızıntıları, aktifleşmiş fagositler (solunumsal patlama), oksidoredüktazlar<br />
(NADPH oksidaz, ksantin oksidaz, glukoz oksidaz, miyeloperoksidaz, P450 enzimleri, siklooksijenazlar), kendiliğinden<br />
oluşan oksidasyon (otooksidasyon) reaksiyonları; dışsal kaynakları ise oksijen varlığında g-ışınları, UV ışınları, ozon,<br />
redoks reaksiyonlarına giren ksenobiyotikler (örneğin, parakuat, karbon tetraklorür), sigara dumanı, ilaçlar <strong>ve</strong><br />
metabolitleridir.<br />
.-<br />
Antioksidan savunma sistemleri yetersiz kaldığı zaman, süperoksit (O 2<br />
), hidroksil (OH . ), peroksil (RO 2.<br />
), alkoksil (RO . ),<br />
hidroperoksil (HO 2.<br />
) gibi radikaller; hidrojen peroksit (H 2<br />
O 2<br />
), hipoklorik asit (HOCl), hipobromik asit (HOBr), ozon (O 3<br />
),<br />
singlet oksijen ( 1 O 2<br />
) <strong>ve</strong> peroksinitrit (ONOO – ) gibi radikal olmayan ROT’lar <strong>ve</strong> Fe +2 , Cu +1 geçiş metallerinin indirgenmiş<br />
iyonları, lipit <strong>ve</strong> serbest amino asitlerin oksidasyonu ile oluşan yan ürünler, amino asitlerin yan zincirlerinde<br />
oksidasyona, dolayısıyla protein hasarlarına yol açarlar. Hasarlı proteinler de, protein-protein çapraz bağlantıları <strong>ve</strong>ya<br />
agregatlar oluşturarak, parçalanarak <strong>ve</strong>/<strong>ve</strong>ya olağan dışı bir grup [örneğin, hidroksinonenal (HNE), malondialdehit<br />
(MDA) <strong>ve</strong> izoketaller gibi lipit peroksidasyon ürünleri] içeren protein türevlerine (“protein adducts”) dönüşerek<br />
işlevlerini yitirirler. Sonuçta enzimatik aktivitenin <strong>ve</strong> bağlanma özelliklerinin ortadan kalkması, agregat oluşturma<br />
eğiliminde <strong>ve</strong> proteolize duyarlılıkta artış, hücre içine alımda artış <strong>ve</strong>ya azalış <strong>ve</strong> immünolojik özelliklerde değişim<br />
gibi istenmeyen olaylar meydana gelir. Amino asit yan zincirlerinde meydana gelebilecek oksidatif değişimler Tablo<br />
31.1’de, oluşan bazı türevlerin yapıları Şekil 31.1’de <strong>ve</strong>rilmiştir.<br />
Oksidasyona en duyarlı amino asitler kükürt içeren sistein <strong>ve</strong> metiyonindir. Farklı ROT’ların etkisiyle bu amino<br />
asitlerde çok çeşitli tipte değişimler meydana gelir (Şekil 31.2). Ancak, birçok biyolojik sistem, sistein <strong>ve</strong> metiyoninin<br />
oksitlenmiş biçimlerini normal biçimlerine dönüştüren disülfit redüktazlara <strong>ve</strong> metiyonin sülfoksit redüktazlara<br />
sahiptir. Proteinlerde onarılabilecek hasarlar sadece bunlardır. Dolayısıyla bu amino asitlerdeki hasarlar proteinin<br />
işlevi üzerinde her zaman olumsuz bir etkiye neden olmayabilir. Metiyonin kalıntısı bazı durumlarda, kritik amino<br />
asil kalıntılarını oksidatif saldırıdan korumak için içsel radikal temizleyici olarak da görev yapar. Oksidatif strese bağlı<br />
protein hasarları birçok hastalıkta <strong>ve</strong> patolojik süreçte yer alır (Tablo 31.2).<br />
Oksidatif stresle ilgili araştırmaların en büyük zorluklarından biri hasarı özgül olarak saptama (hangi proteinlerin<br />
nasıl <strong>ve</strong> ne kadar hasara uğradığını belirleme) güçlüğüdür. Çünkü proteinler tüm doku <strong>ve</strong> hücrelerde yaygın olarak<br />
bulunurlar, hepsi az <strong>ve</strong>ya çok oksidatif değişime uğrarlar <strong>ve</strong> çok farklı hasarlı türevler oluştururlar. Bununla birlikte<br />
genel olarak bakıldığında, protein hasarlarının oksidatif stresin en gü<strong>ve</strong>nilir belirteçlerinden biri olduğu kabul<br />
edilmektedir.<br />
611
31.A<br />
Hidrojen Peroksit Uygulanmış Maya Hücrelerinde<br />
Protein Karbonillerinin Belirlenmesi<br />
Murat PEKMEZ<br />
Protein oksidasyonu sonucunda hücre içinde oluşan protein karbonillerinin saptanması için, dinitrofenilhidrazinin<br />
(DNPH) hasarlı proteine bağlanmasıyla meydana gelen türevin immünolojik olarak belirlenmesi temeline dayanan<br />
yöntem kullanılabilir (Levine <strong>ve</strong> ark., 1990). Bu yöntemde 2,4-dinitrofenilhidrazin ile reaksiyona giren karbonil<br />
grupları, poliakrilamid jel elektroforezinin ardından Western damgalama (“blotting”) tekniğiyle işaretlenir.<br />
Materyal<br />
Schizosaccharomyces pombe Lindner strainliquefaciens (972 h−) maya ırkı<br />
(İstanbul Üni<strong>ve</strong>rsitesi, <strong>Moleküler</strong> <strong>Biyoloji</strong> <strong>ve</strong> Genetik Bölümü kültür koleksiyonundan). Hücreler Gutz <strong>ve</strong> ark.’nın<br />
(1974) önerdikleri standart yöntemlerle üretilir <strong>ve</strong> saklanır. YEL besiyerinde kültürlenen hücreler 30°C’lık çalkalayıcılı<br />
etüvde üretilir.<br />
Gerekli Malzemeler<br />
Besiyeri (“Yeast Extract Liquid”, YEL)<br />
Maya özütü . . . . . . . . . . . . . . . . %0.5<br />
Glukoz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %3<br />
Hidrojen peroksit (H 2<br />
O 2<br />
) . . . . . . . . . . 0.2 mM, 1.0 mM, 2.0 mM<br />
Parçalama tamponu<br />
Tris, pH 7.5 . . . . . . . . . . . . . . . . 50 mM<br />
NaCl. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .150 mM<br />
EDTA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 mM<br />
Gliserol. . . . . . . . . . . . . . . . . . .%10<br />
PMSF * . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 mM<br />
DTT ** . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 mM<br />
*Fenilmetilsülfonil florür<br />
**Ditiyotreitol<br />
Cam boncuklar (çap: 425–600 μm, asitle yıkanmış)<br />
Bradford belirteci (bkz. 26.3)<br />
Sığır serum albümin standart çözeltileri (bkz. 26.3)<br />
SDS jel elektroforezi için gerekli kimyasallar (bkz. 28.2)<br />
Boyama çözeltileri (bkz. 28.4.1)<br />
OxyBlot Kiti (protein oksidasyonu saptama kiti)<br />
1x DNPH çözeltisi (Proteinlerdeki karbonil grupları ile reaksiyona girer)<br />
1x Kontrol çözeltisi (DNPH yerine bu çözelti kullanıldığında, karbonil grupları ile reaksiyon gerçekleşmez)<br />
Nötralizasyon çözeltisi<br />
Primer antikor (anti-DNP antikoru, 1:150)<br />
Sekonder antikor (yaban turpu peroksidazı ile konjüge antikor, 1:300)<br />
617
Protein-Protein Etkileşiminin Belirlenmesi<br />
(Maya İkili Melez Sistemi)<br />
• • • •<br />
Filiz GÜREL<br />
32<br />
Maya ikili melez (“2-Hybrid”) sistemi rekombinant Saccharomyces cerevisiae hücrelerinde iki protein arasındaki<br />
etkileşimin belirlenmesine olanak <strong>ve</strong>ren bir yöntemdir. Bu yöntem özellikle transkripsiyon faktörlerinin yapısının<br />
aydınlatıldığı 1990’lı yılların başlarında geliştirilmiştir. Transkripsiyon faktörlerinin DNA’ya bağlanan <strong>ve</strong> aktifleşmeyi<br />
sağlayan farklı domenlerinin (alanlarının) olduğunun keşfedilmesi sistemin geliştirilmesinde önemli rol oynamıştır.<br />
Sonraları, etkileşen domenlerin aktifleşerek LacZ ya da His + gibi bir raportör geni çalıştırmasıyla bu etkileşim maya<br />
hücresinde saptanabilir hale gelmiştir.<br />
Maya ikili melez sistemi çok çeşitli araştırmalarda kullanılma potansiyeline sahiptir. Bu sistem, bir kez optimizasyonu<br />
yapıldıktan sonra cDNA kitaplıklarının taranmasında kullanılabilir. Kanser gibi karmaşık hücresel sinyal yolaklarının<br />
olduğu hastalıklarda proteinler arası etkileşimlerin haritaları çıkarılarak daha sonra bu etkileşimlerin engellenmesine<br />
yönelik yaklaşımlar geliştirilebilir. Örneğin, bitki moleküler biyolojisinde çiçeklenme gibi çok sayıda proteinin rol<br />
oynadığı hücresel mekanizmaların anlaşılmasında yararlanılmıştır. Günümüzde, geniş ölçekli proteomik analizlere <strong>ve</strong><br />
sonrasında sistem biyolojisine katkı sağlayacak şekilde, bakterilerde, mayada, virüslerde <strong>ve</strong> insanda bazı yolaklardaki<br />
maya-ikili melez sistemi ile protein-protein etkileşim ağları kurulmuştur.<br />
Maya ikili melez sistemi bilinmeyen protein etkileşimlerinin araştırılmasının yanı sıra bilinen etkileşimlerin yapısal <strong>ve</strong><br />
işlevsel analizini de kolaylaştırır. Bu da özellikle mutasyonun kullanıldığı stratejilerde büyük yarar sağlar. Bu açılardan<br />
maya-ikili melez sistemi, önceden kullanılan birlikte fraksiyonlama, birlikte immün çöktürme (bkz. 1.2.16 <strong>ve</strong> Ek Bölüm<br />
25.A) <strong>ve</strong> kromatografi (bkz. 1.2.7) gibi biyokimyasal yöntemlerle karşılaştırıldığında önemli üstünlükler taşır.<br />
32.1. İkili Melez Sisteminin <strong>Temel</strong>i<br />
Maya ikili melez sistemi protein-protein etkileşimini in vivo saptamak üzere tasarlanmıştır. Bu sistemin iki önemli<br />
bileşeni yem (“bait”) adı <strong>ve</strong>rilen bir plazmid tarafından şifrelenen <strong>ve</strong> bilinen bir A proteini ile bu proteinle etkileşecek<br />
olası bir B proteinidir. B proteini maya ikili melez sistemi ile taranacak olan bir cDNA kitaplığı üzerindeki binlerce<br />
cDNA’dan şifrelenebilir. Bu sistemin işleyiş mekanizması transkripsiyonun aktifleşmesine dayandığından, yem<br />
plazmidi üzerindeki A proteini genellikle (bakterilerdeki LexA gibi) bir bağlanma domeni ile birleştirilmiştir (Şekil<br />
32.1). cDNA kitaplığının kurulduğu plazmid üzerindeki cDNA klonları ise (mayadaki GAL4 gibi) bir aktifleşme domeni<br />
ile birleştirilmiştir. Dolayısıyla, her iki plazmidin tek başına maya hücresinde bulunması durumunda nükleustaki<br />
raportör genlerin aktifleşmesi beklenmez. Ancak yem üzerindeki A <strong>ve</strong> cDNA kitaplığındaki B’nin birleşmesi<br />
durumunda oluşacak füzyon (kaynaşmış) proteini nükleusa taşınarak DNA’ya bağlanabilir <strong>ve</strong> maya kromozomundaki<br />
LacZ+ ya da His+ gibi seçici belirteç genlere bağlanarak onların transkripsiyonunu aktifleştirir. Bu durum mayanın<br />
maviye boyanmasına ya da histidin içermeyen (seçici) besiyerinde üreyebilmesine yol açar (Şekil 32.1).<br />
621
33<br />
İzotermal Titrasyon Kalorimetresi<br />
• • • •<br />
Haluk ERTAN<br />
<strong>Biyoloji</strong>k sistemlerde molekül düzeyinde çalışmak mümkün olduktan sonra araştırmacıların önüne deneysel<br />
çalışmalara ilişkin yeni sorunlar (daha duyarlı ölçüm araçları <strong>ve</strong> daha pratik deney malzemelerinin geliştirilmesi<br />
gereği vb.) çıkmıştır. <strong>Biyoloji</strong>k moleküller arasındaki ilişkileri sayısal olarak <strong>ve</strong> gü<strong>ve</strong>nilir şekilde saptayabilmek<br />
moleküler biyolojinin temel amaçlarından biri olduğundan, bu konuda özellikle son 20-30 yıl içinde önemli<br />
gelişmeler kaydedilmiştir. İzotermal titrasyon kalorimetresi (İTC) bu gelişmelerin ürünlerinden biri olarak, 1990’lı<br />
yıllara girilmeden hemen önce piyasaya çıkmıştır.<br />
İzotermal titrasyon kalorimetresi, iki madde ilişkiye girdiğinde oluşan ısı değişimini ölçen bir alettir. Başka bir anlatımla<br />
kalorimetrik tekniği uygulamak için geliştirilmiştir. İTC’nin dayandığı temel ilke; bir çözeltide serbest halde bulunan bir<br />
molekülün bir başka molekülle karşılaşıp bağlantı kurduğunda ortama ısı <strong>ve</strong>rilmesi ya da ortamdan ısı alınmasıdır. İTC,<br />
bağlantı dinamiği incelenmek istenen maddelerin kontrollü bir şekilde karşılaşmasını sağlar <strong>ve</strong> bunun bir sonucu olarak<br />
gelişen ısı değişimini duyarlı bir şekilde ölçer. İTC sayesinde bağlanma işleminin, istenen belli bir sıcaklıkta gerçekleşmesi<br />
izlenir. Örneğin, 2°C ile 80°C arasındaki sıcaklık değerlerinde moleküller arasındaki ilişkileri incelemek olasıdır.<br />
İTC, bir çözelti içinde olmak koşuluyla, her türlü biyolojik <strong>ve</strong>ya biyolojik olmayan sistemdeki ısı değişimini ölçebilir.<br />
Çevremizdeki sayısız olayda moleküller arasında sürekli bir birleşme <strong>ve</strong> ayrılma işlemi gerçekleşir. Örneğin bir hücre<br />
çevresiyle, hücre zarı üzerinde bulunan alıcı molekülleri sayesinde haberleşir. Hücrenin yaşam ortamında yer alan<br />
besin maddeleri, iyonlar, sinyal molekülleri, hormonlar vb. bu algılayıcılara bağlanırlar <strong>ve</strong> hücrenin fizyolojik yanıtı<br />
buradan sağlanan bilgiye göre belirlenir. İlaçlar ya da aşılar da belli moleküllerle ilişkiye girerek iş görürler. Enzimatik<br />
reaksiyon substrat ile enzim arasındaki bir moleküler ilişkidir. Bağışıklık sistemi antijenleri bağlanma yoluyla tanır<br />
<strong>ve</strong> onlara karşı geliştirdiği antikorlar da aynı yolla çalışır. Kanser, nörolojik hastalıklar, yeni ilaçların geliştirilmesi vb.<br />
alanlarda moleküller arası ilişkiler çok önemlidir.<br />
İTC aracılığıyla, bir metal iyonunun proteine bağlanması, bir proteinin bir başka proteine bağlanması <strong>ve</strong>ya protein<br />
molekülünün DNA, RNA gibi farklı bir makromoleküle bağlanması ya da DNA’ya bir aktifleştirici <strong>ve</strong>ya engelleyicinin<br />
bağlanmasına ilişkin termodinamik değerleri saptamak olasıdır. Aynı şekilde bir enzimin aktivitesine ilişkin etkileşim<br />
kinetiği de İTC ile aydınlatılabilir. Moleküller arası tüm bu etkileşimleri temsilen reseptör makromolekülün ligandına<br />
bağlanma reaksiyonu Şekil 35.1’de şematik olarak gösterilmiştir.<br />
+<br />
Reseptör<br />
makromolekül<br />
Ligand<br />
Bağlanma sonucu<br />
oluşan kompleks<br />
Şekil 35.1. Reseptör makromolekül ile ligandının bağlanması.<br />
635
PROTEOMİK ANALİZLER
34<br />
İki Boyutlu Protein Elektroforezi<br />
• • • •<br />
Nazlı ARDA, Evren ÖNAY UÇAR, Haluk ERTAN<br />
<strong>Proteomik</strong> çalışmaların en temel yöntemi olan iki boyutlu elektroforez (“Two Dimensional Electrophoresis”, 2-DE),<br />
adından da anlaşılacağı üzere iki boyutta gerçekleştirilir. Birinci boyutta izoelektrik odaklama (IEF) yöntemiyle<br />
izoelektrik noktalarının (pI) farklılığına dayanarak ayrılan proteinler ikinci boyutta sodyum dodesil sülfatpoliakrilamid<br />
jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile molekül ağırlıklarına göre ayrılırlar.<br />
Bu bölümde önce birinci boyut (IEF) için uygulanabilecek iki farklı yöntem (dikey sistemde hazırlanan tüp jellerle<br />
IEF <strong>ve</strong> yatay sistemde, hazır şeritlerle IEF) anlatılacaktır. Ardından ikinci boyutta (SDS-PAGE) ayrımın nasıl yapıldığı<br />
aktarılacak <strong>ve</strong> uygulanabilecek ileri analizlerden bahsedilecektir. Bölümün en sonunda da süreçte karşılaşılabilecek<br />
sorunların nedenlerine <strong>ve</strong> önlemlerine değinilecektir.<br />
34.1. Birinci Boyut: İzoelektrik Odaklama (IEF)<br />
IEF hem dikey sistemlerde (kapiler bir tüpte ya da kolonda) (bkz. 1.2.8) hem de yatay sistemlerde gerçekleştirilebilir.<br />
Dikey sistemlerde izoelektrik odaklama jeli hazırlamak için, jel boyunca bir pH gradienti oluşturan, izoelektrik<br />
noktaları belli, düşük molekül ağırlıklı amfolitler kullanılır. Belli pH aralıkları ortaya koyan karışımlar şeklinde satılan<br />
bu sentetik maddeler, alifatik poliamino polikarboksilik asit yapısındadırlar.<br />
İzoelektrik odaklama işlemi, çeşitli boylarda, kullanıma hazır IPG (“Immobilized pH Gradient”) şeritleriyle (örneğin,<br />
Bio-Rad ReadyStrip TM , GE Healthcare Immobiline® DryStrip, Sigma ProteoGel TM IPG Strips), yatay sistemlerde (örneğin,<br />
Bio-Rad IEF Cell) gerçekleştirilebilir. pH gradienti bu şeritler üzerinde akrilamid matriksiyle birlikte polimerize edilmiş<br />
taşıyıcı amfolitler (Ampholine®) tarafından sağlanır.<br />
Çalışmada kullanılacak amfolit karışımı <strong>ve</strong>ya kullanıma hazır şerit seçilirken, ayrılması istenen proteinlerin izoelektrik<br />
noktaları göz önünde bulundurulur. Ayrım geniş bir pH aralığında (örneğin, pH 3-10) gerçekleştirilebileceği gibi,<br />
daha dar bir alanda da (örneğin pH 4-5) yürütülebilir.<br />
34.1.1. Dikey Sistemlerde Hazırlanan Jellerle IEF<br />
Gerekli Donanım <strong>ve</strong> Malzemeler<br />
Tüp jel elektroforezi için uygun aygıt [örneğin Hoefer® “Tube Gel Adaptor Kit” (Şekil 34.1a <strong>ve</strong> b), C.B.S. “Tube Gel<br />
Electrophoresis System” (Şekil 1.28a <strong>ve</strong> 34.2a), PROTEAN® II xi 2-D “Tube Gel Cell” (Şekil 34.2b <strong>ve</strong> c)].<br />
649
34.A<br />
C6 Sıçan Glioma Hücrelerindeki Stres Proteinlerinin<br />
<strong>Proteomik</strong> Analizi<br />
Evren ÖNAY UÇAR<br />
Materyal<br />
C6 sıçan glioma hücreleri (%5 CO 2<br />
sağlayan etüvde, 37°C’da üretilir <strong>ve</strong> 3 günde bir alt kültürleme işlemi yapılır).<br />
Gerekli Malzemeler<br />
DMEM/F12 HAM (“Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 HAM”) Besiyeri (pH 7.0)<br />
Fetal sığır serumu (FBS) . . . . . . . . %10<br />
Streptomisin . . . . . . . . . . . . . . .100 U/mL<br />
Penisilin . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100 µg/mL<br />
Amfoterisin B . . . . . . . . . . . . . . .0.25 µg/mL<br />
(D)PBS (“Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline”) (pH 7.0)<br />
Tripsin/EDTA<br />
Tripsin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %0.2<br />
EDTA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %0.04<br />
Lizis tamponu (pH 7.4)<br />
Üre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 M<br />
CHAPS . . . . . . . . . . . . . . . . . . .%4<br />
(3-[(3-kolamidopropil) dimetilamino]-1-propan sülfonat)<br />
Amfolit (pH 3-10) . . . . . . . . . . . . %0.5<br />
DTT (ditiyotreitol) . . . . . . . . . . . .50 mM<br />
Tris . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40 mM<br />
75 cm 2 ’lik kültür kapları<br />
Bradford belirteci (bkz. 26.3)<br />
Sığır serum albümin standart çözeltileri (bkz. 26.3)<br />
İzoelektrik odaklama şeritleri (Bio-Rad 163-2008)<br />
İzoelektrik odaklama kiti (Bio-Rad 163-2105)<br />
SDS -PAGE için gerekli kimyasallar (bkz. 28.2)<br />
Boyama çözeltileri (bkz. 28.4.1)<br />
Asetonitril (ACN) (%100 <strong>ve</strong> %50’lik)<br />
200 mM Amonyum bikarbonat (NH 4<br />
HCO 3<br />
) (%50 asetonitril içinde hazırlanır.)<br />
50 mM Amonyum bikarbonat (NH 4<br />
HCO 3<br />
) (%50 asetonitril içinde hazırlanır/tripsin çözeltisini hazırlamak için kullanılır.)<br />
10 ng/μL Tripsin (Sigma-Proteomics grade) (50 mM NH 4<br />
HCO 3<br />
içinde hazırlanır.)<br />
α-Siyano-4-hidroksisinnamik asit (CHCA)<br />
CHCA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10 mg/mL<br />
H 2<br />
O . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %40 (v/v)<br />
667
35<br />
İki Boyutlu DIGE<br />
• • • •<br />
Murat KASAP, Gürler AKPINAR<br />
İki boyutlu (2D) jel elektroforezi çok eski bir teknik olmasına rağmen proteomik çalışmalarında halen güncelliğini<br />
korumaktadır. Bunun en temel nedeni 2D yaklaşımın binlerce proteini aynı anda görüntüleyebilme, karşılaştırmalı<br />
olarak hem kalitatif hem de kantitatif olarak analiz edebilme <strong>ve</strong> eğer varsa translasyon sonrası değişimleri<br />
gösterebilmesinden kaynaklanmaktadır (bkz. Bölüm 34).<br />
Klasik 2D jel elektroforezinde harcanması gerekli olan dikkat <strong>ve</strong> enerji, dolayısıyla iş yükü oldukça fazladır. Deneyimler<br />
dört farklı örnek ile yapılacak klasik bir 2D jel elektroforezi çalışmasının, jellerin görüntülenme aşamasına gelene<br />
kadar yaklaşık 5-7 gün arasında sürdüğünü göstermektedir. Bu nedenle özellikle klinik çalışmalarda daha gü<strong>ve</strong>nilir<br />
<strong>ve</strong> iş yükü nispeten daha az bir yaklaşıma ihtiyaç duyulmaktadır. Bu ihtiyacı karşılayan en pratik <strong>ve</strong> gü<strong>ve</strong>nilir yaklaşım<br />
iki boyutlu diferansiyel (floresans ayrımlı) jel eletroforezi [2D-DIGE, ”Differential (Fluorescence Difference)<br />
Gel Electrophoresis”] yöntemidir.<br />
2D-DIGE tekniği ilk olarak Mustafa Ünlü <strong>ve</strong> arkadaşları (Unlü <strong>ve</strong> ark. 1997) tarafından geliştirilmiştir. Bu yöntem bizlere<br />
birden fazla protein örneğini farklı floresan boyalar ile işaretleyerek tek bir IPG (“Immobilized pH Gradient”) şerit <strong>ve</strong><br />
yine tek bir jel üzerinde ayırma olanağı sağlamaktadır. Bu sayede, büyük bir sorun oluşturan farklı odaklanma <strong>ve</strong><br />
jelden jele oluşan yürüme farklılıkları ortadan kaldırılmış olur. DIGE’nin temel prensibinde farklı protein örneklerinin<br />
ayrımdan önce floresan siyanin boyalarla (Cy2, Cy3 <strong>ve</strong> Cy5) işaretlenmesi yatmaktadır. DIGE işaretleme deneylerinde<br />
kullanılan floresan boyaların özellikleri dört açıdan optimize edilmiştir: (1) Boyalardan her biri aynı amino asitle<br />
reaksiyon <strong>ve</strong>rmektedir (minimal işaretleme için lizin, doymuş işaretleme için ise sistein amino asidi), (2) Boyalar<br />
işaretlediği amino asidin yükünü değiştirmemektedir, (3) Boyaların moleküler ağırlıkları birbirine çok yakındır (~500<br />
Da), (4) Boyaların ayırt edici floresan özellikleri vardır. Hücresel sinyal yolaklarının <strong>ve</strong> birçok hastalığın araştırılmasında,<br />
gelişimsel biyoloji, sinirbilim, nefroloji <strong>ve</strong> bitki biyoteknolojisinde DIGE tekniği kullanım alanı bulmuş <strong>ve</strong> genomik<br />
sonrası dönemin önemli yöntemlerinden biri haline gelmiştir. 2017 itibarı ile PubMed’de “2D DIGE difference gel<br />
electrophoresis” anahtar kelimeleri kullanılarak yapılan aramada 2329’dan fazla yayının bulunması bu yöntemin<br />
artık standart hale geldiğinin bir göstergesidir.<br />
2D-DIGE yönteminde kullanılan floresan boyalar (CyDye), Coomassie mavisine göre çok daha duyarlı, gümüş nitrat<br />
boyamaya göre daha yüksek bir dinamik çalışma aralığı sunar. Tablo 35.1’de bu boyaların duyarlılıkları, eksitasyon<br />
(uyarılma) <strong>ve</strong> emisyon (yayım) dalga boyları <strong>ve</strong>rilmiştir. Kaba bir karşılaştırma ile 2D-DIGE’de spot başına 0.2 ng kadar<br />
Tablo 35.1. Floresan boyalara ait özellikler<br />
GyDye Maksimum duyarlılık (ng) Eksitasyon dalga boyu (nm) Emisyon dalga boyu (nm)<br />
Cy2 0.075 492 510<br />
Cy3 0.025 550 570<br />
Cy5 0.025 650 670<br />
675
36<br />
Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometrisi<br />
(LC-MS) Proteomiği<br />
• • • •<br />
Volkan YILDIRIM, Gülay ÖZCENGİZ<br />
Sıvı kromatografi (“Liquid Chromatography”, LC) ile ayrılan protein karışımının kütle spektrometrisi (“Mass Spectrometry”,<br />
MS) ile analizine dayanan LC-MS yöntemi günümüz proteom teknolojilerinin en vazgeçilmez yöntemlerinden biri olup,<br />
sıvı kromatografi cihazı ile kütle spektrometresinin birleşiminden oluşan LC-MS sistemiyle gerçekleştirilir. LC-MS temelli<br />
bir proteom çalışmasında süreç kısaca şu basamaklardan oluşur: (1) Analizi yapılacak proteinlerin istenen örnekten<br />
çalışmanın amacına uygun olarak izole edilmesi; (2) Proteinlerin tripsin enzimiyle işleme sokulması; (3) Tripsin kesimi<br />
sonucu ortaya çıkan peptidlerin kütle spektrometresine bağlı bir sıvı kromatografi kolonuna yüklenerek birbirlerinden<br />
ayrıştırılması; (4) Sıvı kromatografi kolonundan çıkan her bir fragmentin kütle spektrometresi ile analizi; (5) Analiz<br />
sonrası elde edilen <strong>ve</strong>rilerin uygun protein <strong>ve</strong>ritabanlarında taranarak proteinlerin tanımlanması. Bu yolla, kullanılan<br />
biyolojik örneğin türüne bağlı olarak tek bir deney serisinde yüzlerce hatta binlerce protein tanımlanabilmektedir.<br />
36.1. LC-MS’de Kullanılan Sıvı Kromatografi Aletleri<br />
LC-MS sistemlerinde genelde kullanılan sıvı kromatografi tipi, yüksek basınçlı sıvı kromatografi (“High Pressure Liquid<br />
Chromatography”, HPLC)’dir (ayrıntılı bilgi için bkz. 1.2.7). HPLC cihazlarında en çok kullanılan kolon tipi ise ters faz<br />
(“re<strong>ve</strong>rse-phase”, RP) kolonlardır. Bu kolonlarda kullanılan tampon sistemlerinin tuz içermemesi <strong>ve</strong> göreceli olarak yüksek<br />
ayrıştırma güçleri, RP kolonlarını proteom çalışmalarında en çok kullanılan kolon tipi haline getirmiştir. Bir RP kolonu,<br />
üzerine sekiz <strong>ve</strong>ya on sekiz karbonlu (C8, C18) alkil grupları bağlanmış 3-5 µm çapındaki silika küreciklerden oluşur.<br />
Polar olmayan bu alkil grupları sayesinde protein/peptidler, çok polar olanlardan polar olmayanlara doğru, polarite<br />
derecelerine göre ayrıştırılırlar. Silika küreciklerin çapı küçültülerek kolonun ayrıştırma gücü artırılabilmekte, fakat bu<br />
durumda daha yüksek basınçlar uygulamak gerekmektedir. Böyle yüksek basınçlarda çalışan kromatografi sistemlerine<br />
ultra yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (UPLC, “Ultra High Pressure Liquid Chromatography”) denilmektedir.<br />
Bu yüksek ayrıştırma gücünden ötürü günümüzde birçok çalışmada UPLC-MS sistemleri tercih edilmektedir.<br />
Bazı karmaşık peptid karışımlarının ayrıştırılmasında iki farklı kolon ardışık olarak kullanılabilir. Bu tür bir ayrıştırma<br />
işlemine iki boyutlu sıvı kromatografi (2D-LC) denilmektedir. 2D-LC kullanılarak protein tanımlama işlemi ise çok<br />
boyutlu protein tanımlama teknolojisi (“Multi Dimensional Protein Identification Technology”, MuDPIT) olarak<br />
adlandırılır. Bu sistemlerde genellikle ilk kolon güçlü bir katyon değiştirici (“Strong Cation eXchange”, SCX) kolon, ikinci<br />
kolon ise bir RP kolonudur. Bir MuDPIT çalışmasında önce toplam protein izolatı disülfit bağlarının kırılması için indirgenir<br />
<strong>ve</strong> disülfit bağlarının tekrar birleşmemesi için alkillenir. Daha sonra tripsin gibi bir proteaz uygulamasıyla kompleks bir<br />
peptid karışımı elde edilir. Bu karışım bir SCX-RP-HPLC-MS/MS sistemine yüklenerek analiz edilir <strong>ve</strong> protein/peptid<br />
tanımlamaları yapılır.<br />
36.2. Kütle Spektrometrisi<br />
Kütle spektrometrisi yöntemi temel olarak bir kütle spektrometresinde moleküllerin kütle/elektrik yükü oranını<br />
(m/z) ölçerek molekülün kütlesinin belirlenmesini sağlar. Geleneksel bir kütle spektrometresi, iyonizasyon kaynağı,<br />
analizör <strong>ve</strong> detektör olmak üzere üç ana kısımdan oluşur (bkz. Şekil 1.59).<br />
687
BİYOENFORMATİK
37<br />
Genom <strong>ve</strong> Proteom Analizinde<br />
Biyoenformatik<br />
• • • •<br />
Ercan ARICAN<br />
37.1. <strong>Biyoloji</strong>k Veri Tabanları<br />
<strong>Biyoloji</strong>k <strong>ve</strong>ri tabanlarının iki temel işlevi vardır:<br />
1. <strong>Biyoloji</strong>k <strong>ve</strong>rilerin bilim insanları tarafından daha hızlı <strong>ve</strong> kolay ulaşılabilir hale getirilmesi. Belirli bir<br />
alanda üretilmiş, olabildiğince kapsamlı bilgiler tek bir yerde (örneğin, kitap, dijital ortam, <strong>ve</strong>ri tabanı) toplanmalıdır.<br />
Yayınlanmış <strong>ve</strong>rileri bulmak ya da onlara ulaşmak zor olabilir <strong>ve</strong> literatürden bunları toplamak zaman kaybına yol<br />
açabilir. Ayrıca, bir konuya ilişkin bütün <strong>ve</strong>rileri tek bir yazılı kaynakta toplamak pratik olarak oldukça zor, hatta çoğu<br />
zaman olanaksızdır.<br />
2. <strong>Biyoloji</strong>k <strong>ve</strong>rilerin dijital formda depolanması <strong>ve</strong> kullanıma sunulması. Bilgisayarlar bilim insanları tarafından<br />
ulaşılabilir oldukları günden bu yana <strong>ve</strong>rileri depolamak için de tercih edilen araçlar haline gelmiştir. <strong>Biyoloji</strong>k dizi<br />
<strong>ve</strong>ri tabanlarının ilki belki de Margaret Oakley Dayhoff <strong>ve</strong> çalışma arkadaşları tarafından 1965 yılından itibaren seri<br />
olarak yayımlanan <strong>ve</strong> yeni baskıları 1970’lere kadar yapılan Protein Dizileri <strong>ve</strong> Yapıları Atlası isimli kitaptır. O zamana<br />
kadar belirlenen protein dizilerini içermekte olan kitaptaki <strong>ve</strong>riler PIR <strong>ve</strong>ri tabanı (bkz. 37.5) için temel olmuştur.<br />
Günümüzde özellikle moleküler biyolojik <strong>ve</strong>rilerin analizi çoğunlukla bilgisayarlarla yapıldığından, gerekli olan ilk<br />
adım <strong>ve</strong>rilerin (kağıt üzerine yazdırılmış olması yerine) bilgisayarlar tarafından okunacak biçime getirilmesidir. Veri<br />
tabanları önce bantların <strong>ve</strong> sonra farklı tiplerde disklerin üzerine yayılmıştır. Üni<strong>ve</strong>rsiteler <strong>ve</strong> akademik enstitüler<br />
İnternet ya da onun öncüleri (ulusal bilgisayar ağları) ile bağlandığından, neden bilgisayarın depolama tercihi<br />
olduğunu anlamak kolaylaşmıştır. Bununla bağlantılı olarak, neden (HTTP internet protokolüne dayanan) World<br />
Wide Web (WWW)’in 1990’ların başından itibaren biyolojik <strong>ve</strong>rilere ulaşım <strong>ve</strong> <strong>ve</strong>riler arası iletişim için klasik protokol<br />
olduğu da daha iyi anlaşılmaktadır.<br />
Teknolojinin de ilerlemesiyle birlikte daha çok <strong>ve</strong>ri zengini bir bilim haline gelen biyolojide, geniş <strong>ve</strong>ri serilerini<br />
depolama, <strong>ve</strong>rileri anlamlandırma, <strong>ve</strong>riler arasındaki ilişkileri ortaya çıkartma <strong>ve</strong> hızlı iletişim ağları kurma gereksinimi<br />
inanılmaz ölçüde artmıştır. Bu tip <strong>ve</strong>rilerin en tipik örnekleri nükleotid dizileri, protein dizileri, <strong>ve</strong> X-ışını kristallografisi<br />
<strong>ve</strong> makromoleküler NMR ile elde edilen üç boyutlu yapısal <strong>ve</strong>rilerdir. Bu <strong>ve</strong>ri tabanları ile ilişkili sorun, görev <strong>ve</strong><br />
yeni olanaklarla uğraşan yeni bir bilim olarak biyoenformatik doğmuştur. Veri tabanlarında bulunan ya da yakın<br />
zamanda bulunacak olan diğer <strong>ve</strong>ri türleri metabolik yollar, gen anlatımı <strong>ve</strong>rileri (mikrodizinler) <strong>ve</strong> biyolojik işlev <strong>ve</strong><br />
olaylarla ilgili diğer <strong>ve</strong>ri türleridir.<br />
Günümüzde yaşam bilimlerinin genomik, transkriptomik, proteomik, filogeni, sistem biyolojisi, populasyon genetiği<br />
vb. alanlarında bilimsel <strong>ve</strong>ri tabanlarına <strong>ve</strong> yazılım araçlarına bilgisayarlar üzerinden giriş sağlayan <strong>ve</strong> moleküler<br />
biyologların en çok kullandığı, SIB (“Swiss Institute of Bioinformatics”)’nin ExPASy biyoenformatik kaynak portalıdır.<br />
703
37.A<br />
Mayada (Saccharomyces cerevisiae) Süperoksit Dismutaz<br />
(SOD) Enziminin BLAST Analizi<br />
Çağatay TARHAN<br />
Protein ya da DNA dizileri arasında belirli homolojilerin varlığı, dizisi yeni ortaya çıkarılan proteinlerin ya da<br />
DNA’ların işlevine ilişkin tahmin yürütülebilmesine olanak sağlar. DNA <strong>ve</strong> amino asit dizilerine ilişkin <strong>ve</strong>ri tabanları<br />
zenginleştikçe homolojileri saptama olasılığı arttığından, bu <strong>ve</strong>ri tabanları yeni dizilenen genlerin <strong>ve</strong> proteinlerin<br />
incelenmesinde oldukça kullanışlı hale gelmiştir.<br />
BLAST (“Basic Local Alignament and Search Tool”) analizi (Altschul <strong>ve</strong> ark., 1990), belirli bir <strong>ve</strong>ri tabanında yer alan<br />
<strong>ve</strong> dizisi bilinen bir proteine ya da DNA parçasına benzeyen diğer protein ya da nükleotid dizilerini bulmak için<br />
uygulanır. Program, birbiriyle eşleşen dizileri bulduğu gibi bu eşleşmelerin istatistiksel olarak anlamlı olup olmadığını<br />
da ortaya koyar. Böylece <strong>ve</strong>ri tabanında bulunan diziler arasındaki işlevsel <strong>ve</strong> evrimsel ilişkilerin belirlenebilmesinin<br />
yanında gen ya da protein ailelerinin üyelerini tanımlamak da mümkün olur.<br />
Pek çok internet sayfası BLAST uygulamasına olanak <strong>ve</strong>rse de burada, temel karşılaştırmalar için sıklıkla kullanılan<br />
NCBI sayfasındaki uygulama örnek olarak <strong>ve</strong>rilecektir. BLAST sayfasına ulaşmak için ücretsiz bir <strong>ve</strong>ri tabanı olan<br />
PubMed ana sayfasına (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/) girilip buradaki BLAST sekmesine tıklanmalıdır.<br />
BLAST sayfası açıldıktan sonra ise “protein blast” kısmına tıklanarak aşağıdaki ekrana ulaşılır (Şekil 1).<br />
39-1. Mayada (Saccharomyces cerevisiae) Süperoksit Dismutaz (SOD) Enziminin BLAST analizi<br />
Çağatay TARHAN<br />
Şekil 1. Protein BLAST uygulamasının Şekil 1. Protein gerçekleştirilebileceği BLAST uygulamasının sayfa. gerçekleştirilebileceği sayfa.<br />
Öncelikle BLAST analizi yapılacak protein ya da genin dizisi elde edilir. Bu dizi metin içerikli özel bir biçim olan FASTA<br />
biçiminde olmalıdır. Bir proteinin dizisini FASTA formatında elde etmek için PubMed ana sayfasına girilip buradan<br />
Protein kısmı seçilmelidir (Şekil 2).<br />
717
Ekler<br />
• • • •<br />
Ek 1<br />
<strong>Moleküler</strong> <strong>Biyoloji</strong> Laboratuvarlarında Bulunması Gereken Çeşitli Aletler<br />
• Otoklav<br />
• Kuru hava sterilizatörü (Pasteur fırını)<br />
• Teraziler (analitik <strong>ve</strong> preparatif)<br />
• Buzdolabı (4°C) <strong>ve</strong> derin dondurucular (-20°C, -80°C)<br />
• Saf <strong>ve</strong> deiyonize su aletleri<br />
• Çeker ocak<br />
• Steril çalışma kabini (“laminar flow”)<br />
• Etüvler (kullanılan mikroorganizmanın üremesi için<br />
gerekli sıcaklık derecelerine, örneğin 30 <strong>ve</strong> 37°C’a<br />
ayarlanmış durumda)<br />
• Büyütme kabini (fitotron) (ışık, nem <strong>ve</strong> sıcaklığı<br />
ayarlanabilen)<br />
• CO 2<br />
’li etüv<br />
• Çalkalamalı etüv (değişik hacimlerde kültür kaplarının<br />
kullanılabileceği, sıcaklığı <strong>ve</strong> hızı ayarlanabilir, dairesel<br />
dönüm yapabilen)<br />
• Su banyosu (hareketsiz <strong>ve</strong> çalkalama yapabilen)<br />
• Vakum pompası<br />
• Vakumlu buharlaştırıcı<br />
• Dondurarak kurutma aygıtı (Liyofilizatör)<br />
• Tüp karıştırıcı<br />
• Manyetik karıştırıcı<br />
• pH-metre<br />
• Sıvı azot tankı<br />
• Mikrodalga fırın<br />
• Buz makinesi<br />
• Isıtıcı tabla<br />
• Otomatik mikropipetler (1-1.000 µL kapasiteli)<br />
• Mikroskoplar (ışık, faz kontrast, konfokal, elektron)<br />
• Homojenizatörler<br />
• Santrifüjler (yüksek hızlı soğutmalı santrifüj,<br />
ultrasantrifüj <strong>ve</strong> mikrosantrifüj)<br />
• Filtrasyon aleti (membran filtreli)<br />
• Peristaltik pompa<br />
• Kromatografi kolonları (çeşitli boyutlarda)<br />
• Fraksiyon toplayıcı<br />
• Spektrofotometre (UV <strong>ve</strong> görünür ışık kaynaklı)<br />
• Jel elektroforez sistemleri (normal boyda <strong>ve</strong> mini yatay<br />
jel, dikey jel <strong>ve</strong> iki boyutlu jel elektroforezi için gerekli<br />
olan özel düzenekler)<br />
• Güç kaynakları (agaroz <strong>ve</strong> poliakrilamid jeller için ~500<br />
Volt, DNA dizilemesi için >2000 Volt)<br />
• UV ışık kaynakları (kısa <strong>ve</strong> uzun dalgalı)<br />
• Transillüminatör<br />
• PCR aleti (“thermal cycler”)<br />
• Geiger sayacı<br />
• Radyasyon kalkanı<br />
• Işıma sayacı (“scintillation counter”)<br />
• Bilgisayar <strong>ve</strong> yazıcı<br />
• Dijital jel görüntüleme sistemi<br />
• Densitometre<br />
• Ultrasonikatör<br />
• HPLC/UPLC<br />
• RT-PCR<br />
• DNA dizileme cihazı<br />
• Spektroflorometre<br />
• GC-MS<br />
• LC-MS<br />
• NMR<br />
• Akım sitometre (Akan hücre ölçer, “flow cytometer”)<br />
721
Dizin<br />
• • • •<br />
A<br />
α-Amino asitler, 750, 751<br />
A 260<br />
/A 280<br />
oranı, 127, 503, 504<br />
Absorpsiyon (soğurma)/ekstinksiyon<br />
katsayısı, 35, 596<br />
Absorptivite, 35<br />
aCGH (“array CGH”), 370<br />
Açılan kova (“swinging bucket”) tipindeki<br />
rotor, 11<br />
Adeno-ilişkili virüs, 215<br />
Adenovirüsler, 215<br />
Adsorpsiyon (tutunma) kromatografisi, 19<br />
Afinite elüsyonu, 579, 580<br />
Afinite (ilgi) kromatografisi, 23, 572, 583, 584,<br />
759<br />
Afinite matriksleri, 759<br />
AFLP (“amplified fragment length<br />
polymorphism”), 318, 463<br />
Agar agar, 129<br />
Agaroz, 129<br />
Agaroz jel elektroforezi, 28, 129<br />
Agregasyon, 479<br />
Aile soy ağacı (“pedigree”) analizi, 319, 323<br />
Akış sitometrisi (“flow cytometry”), 275<br />
Akonitat tamponu, 727<br />
Akrep primerleri, 403<br />
Akrilamid, 523<br />
Alkalin fosfataz (“alkaline phosphatase”, AP),<br />
513, 549<br />
Allele özgü oligonükleotid (ASO), 147<br />
Alternatif kırpılma, 360<br />
Alt klonlama (“subcloning”), 248<br />
Alu-PCR, 356<br />
Amido karası (“Amido Black”), 527, 559<br />
Amino asit dizilerinin belirlenmesi, 51<br />
Amino asitler, 1, 749<br />
Amino asit rasemikleşmesi yöntemi, 85<br />
Ammediol tamponu, 727<br />
Amonyak uygulaması, 482<br />
Amonyum persülfat, 523<br />
Amonyum sülfat, 490, 491, 492<br />
Amonyum sülfat çöktürmesi, 490<br />
Ana kural (sentral dogma), 2<br />
Analitik protein mikrodizilimi, 445<br />
Analitik santrifüjleme, 16<br />
Analitik teknikler, 7<br />
Anlatım (ekspresyon) <strong>ve</strong>ktörleri, 218, 253<br />
Anlatımı yapılan dizi etiketleri (“expressed<br />
sequence tags”, EST’ler), 360<br />
Anlatımsal farklılık analizi (“representational<br />
difference analysis”, RDA), 365<br />
Anlatım yapan dizi etiketleri, 332<br />
Antik (fosil) DNA, 83<br />
Antikor, 498<br />
Antikor afinite kromatografisi, 572<br />
Anyon değiştirici, 575, 576, 577<br />
Apoptotik ölüm, 103<br />
Apoptoz, 103, 105<br />
Aprotinin, 496<br />
Araya girmiş tekrarlı element PCR, 356<br />
Ardışık (kademeli) elüsyon, 579<br />
Ardışık (“tandem”) kütle spektrometrisi (MS/<br />
MS), 52<br />
Argonot, 123<br />
ARS (“autonomously replicating sequence”),<br />
208<br />
Asetat tamponu, 728<br />
Asetill(n)me, 164, 467<br />
Aseton tozu, 480, 481, 483<br />
Asidifikasyon, 479<br />
Asimetrik PCR, 304<br />
Aşağı çekilme, 61<br />
Atmosferik basınç sıvı kromatografisi, 19<br />
Avidin, 167<br />
Av plazmidi, 623<br />
Av protein, 57<br />
Ayakizi analizi, 263<br />
Ayırma (separasyon), 7<br />
Ayırma (“separating”) jeli, 524<br />
B<br />
Bağlanma domeni, 621<br />
Bağlantı, 320<br />
Bağlantı grubu, 320<br />
Bağlantı (rekombinasyon) haritalaması, 316,<br />
319, 320<br />
Bağlantısız genler, 320<br />
Bağlayıcı (“linker”) molekül, 220<br />
Bakteri yapay kromozomu (BAC), 209<br />
Balistik homojenizatör, 5, 482<br />
Barbital tamponu, 728<br />
Basit dizi tekrarları (“simple sequence<br />
repeats”, SSR’ler), 318<br />
Basit dizi tekrarları araları, 318<br />
Basit dizi uzunluğu polimofizmi, 332<br />
Basit şekerler, 1<br />
Baskılayıcı kayıplı melezleme (“Suppression<br />
Subtracti<strong>ve</strong> Hybridization”, SSH), 364<br />
Başlangıç hızı (“initial-rate”, v o<br />
), 592, 593<br />
BCA belirteci, 507<br />
BCA yöntemi, 509, 510, 511, 752<br />
BCIP (5-bromo-4-kloro-3-indolilfosfat), 549<br />
Becquerel (Bq), 39<br />
Beer-Lambert yasası, 35, 596<br />
Belirteç genin kurtarılması (“marker rescue”),<br />
240<br />
Belirteç (“marker”) gen, 203, 239, 246<br />
763
Change language