T.C. Süleyman Demirel Üniversitesi Tıp Fakültesi Enfeksiyon ...
T.C. Süleyman Demirel Üniversitesi Tıp Fakültesi Enfeksiyon ...
T.C. Süleyman Demirel Üniversitesi Tıp Fakültesi Enfeksiyon ...
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
eppendorf tüpüne aktarıldı. Eppendorf tüpleri içindeki örnekler çalışılacağı<br />
güne kadar -80ºC’de saklandı.<br />
4.3. Hasta ve kontrol grubunun serumlarında ELISA yöntemi ile IFN-γ, IL-2,<br />
IL-6, TNF-α, IL-10 düzeylerinin belirlenmesi:<br />
4.3.1. Hasta ve kontrol grubu serum örneklerinde ELISA yöntemi ile IFN-γ<br />
düzeyinin belirlenmesi:<br />
Kit içerisindeki maddeler kullanmadan önce oda ısısında 30 dakika<br />
bekletildi. Standart, standart dilüsyon sıvısı ile konsantre hale getirildikten sonra<br />
5000 pg/ml konsantrasyonunda standart solüsyonu hazırlandı. 100 µlt<br />
konsantre standart solüsyonu ile 400 µlt standart dilüsyon sıvısı plastik tüp<br />
içinde karıştırılarak 1000 pg/ml konsantrasyonda Hu-IFN γ içeren solüsyon elde<br />
edilmiş oldu. Daha sonra altı adet plastik tüplere 150 µlt standart dilüsyon sıvısı<br />
konuldu ve 1000 pg/ml konsantre standart solüsyondan seri dilüsyonlarla tablo<br />
2’de görüldüğü gibi 500, 250, 125, 62,5, 31,2 ve 15,6 pg/ml IFN γ içeren<br />
standartlar hazırlanmış oldu.<br />
Kit içeriğinde belirtildiği gibi Streptavidin-peroksidaz konsantre<br />
solusyunundan 120 µlt ve streptavidin peroksidaz dilüsyon sıvısından 12 ml<br />
plastik bir tüp içinde dilüe edildi. Yıkama için kullanılacak solüsyon 950 ml<br />
distile su ile karıştırılarak, 1/20 oranında dilüe edildi.<br />
Tablo 2. IFN-γ seri dilüsyonlarının hazırlanması<br />
Standart konsantrasyon IFN-γ Dilüsyon sıvısı<br />
500pg/ml 150µlt 1000 pg/ml standart<br />
solüsyon<br />
150µlt<br />
250pg/ml 150µlt 500 pg/ml standart<br />
solüsyon<br />
150µlt<br />
125pg/ml 150µlt 250 pg/ml standart<br />
solüsyon<br />
150µlt<br />
62,5pg/ml 150µlt 125 pg/ml standart 150µlt<br />
solüsyon<br />
31,2pg/ml 150µlt 62,5 pg/ml standart 150µlt<br />
solüsyon<br />
15,6pg/ml 150µlt 31,2 pg/ml standart 150µlt<br />
0 pg/ml<br />
solüsyon<br />
150µlt<br />
Kit içindeki yüksek vakumda kurutulmuş (liyofilize) komponentlerin<br />
çözünmesinden sonra 10 dakika beklendi. Yıkama için kullanılacak solüsyon<br />
950 ml distile su ile karıştırılarak, 1/20 oranında dilüe edildi. Tüm<br />
kuyucuklara 50 µlt inkübasyon tampon solüsyonundan konuldu. Daha sonra<br />
standart veya serum örneklerinden 50 µlt tüm kuyucuklara konuldu. Folyo ile<br />
plağın üstü kapatılarak 1,5 saat oda ısısında bekletildi. Beklemeden sonra tüm<br />
kuyucuklar biyokimya laboratuvarında ELX50 Auto Strip Washer ile dört<br />
kez yıkandı. dördüncü yıkama sonrasında kuyucuklar içindeki solüsyonun<br />
tamamen aspire edilmiş olduğuna dikkat edildi. Daha sonra her kuyucuğa<br />
streptavidin-peroksidaz solüsyonundan 100 µlt eklendi. Plağın üstü yeni bir<br />
folyo ile kapatılarak 45 dakika oda ısısında bekletildi. Beklemeden sonra<br />
29
Change language