T.C. Süleyman Demirel Üniversitesi Tıp Fakültesi Enfeksiyon ...
T.C. Süleyman Demirel Üniversitesi Tıp Fakültesi Enfeksiyon ...
T.C. Süleyman Demirel Üniversitesi Tıp Fakültesi Enfeksiyon ...
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
4.3.4 Hasta ve kontrol grubu serum örneklerinde ELISA yöntemi ile TNF-α<br />
düzeyinin belirlenmesi:<br />
Yıkama için kullanılacak solüsyon 950 ml distile su ile karıştırılarak 1/20<br />
oranında dilüe edildi. Liyofilize TNF-α 1 ml dilüent buffer ile dilüe edildi.<br />
Böylece 10 ng/ml konsantrasyonunda stok standart solüsyon elde edilmiş<br />
oldu. Tablo 5’de gösterildiği gibi stok solüsyondan ve dilüsyon sıvısından,<br />
uygun miktarda kullanılarak 1000 pg/ml, 500 pg/ml, 250 pg/ml, 125 pg/ml, 62,5<br />
pg/ml, 30 pg/ml, 15 pg/ml ve 0 pg/ml dilüsyonlarında plastik tüplere seri<br />
dilüsyonları elde edildi.<br />
Tablo 5. TNF-α seri dilüsyonlarının hazırlanması<br />
Standart konsantrasyon TNF--α Dilüsyon sıvısı<br />
1000pg/ml 100µlt<br />
solüsyon<br />
10ng/ml standart 900µlt<br />
500pg/ml 250µlt 1000pg/ml standart 250µlt<br />
solüsyon<br />
250pg/ml 250µlt 500pg/ml standart 250µlt<br />
125pg/ml<br />
solüsyon<br />
250µlt<br />
solüsyon<br />
250pg/ml standart 250µlt<br />
62,5 pg/ml 250µlt<br />
solüsyon<br />
125pg/ml standart 250µlt<br />
30pg/ml 250µlt<br />
solüsyon<br />
62,5pg/ml standart 250µlt<br />
15pg/ml 250µlt<br />
solüsyon<br />
30pg/ml standart 250µlt<br />
0pg/ml 250µlt<br />
96 kuyucuk içeren plak üzerinde her bir kuyucuğa 50 µlt dilüent buffer<br />
ve 50 µlt serum örneği konuldu. Plağın üstü kit içerisinde bulunan folyo ile ışık<br />
görmeyecek şekilde kapatılarak 18-25ºC’de 120 dakika inkübe edildi. Daha<br />
sonra ELX50 Auto Strip Washer ile kuyucuklar üç defa yıkandı. Üçüncü<br />
yıkama sonrasında kuyucuklar içindeki solüsyonun tamamen aspire edilmiş<br />
olduğuna dikkat edildi. Daha sonra her bir kuyucuğa 100 µlt konjugat<br />
eklenerek, plağın üstü ışık görmeyecek şekilde yeni bir folyo ile kapatıldıkdan<br />
sonra 60 dakika18-25ºC’de inkübe edildi. Daha sonra plak içindeki kuyucuklar<br />
tekrar 3 kez yıkandı. Yıkama işleminden sonra her bir kuyucuğa kit içinde<br />
bulunan 100 µlt streptavidin-peroksidaz solüsyonu konularak, plağın üstü ışıktan<br />
korunacak şekilde folyo ile tekrar kapatıldıktan sonra 30 dakika 18-25ºC’de<br />
inkübe edildi. Daha sonra plağın içindeki kuyucuklar üçüncü kez yıkandı. Her<br />
bir kuyucuğa 100 µlt substrat solüsyonundan eklendi. Plak üzeri kapatılmadan<br />
karanlık bir ortamda 18-25ºC’de 30 dakika inkübe edildi. Son olarak her bir<br />
kuyucuğa 100 µlt stop solüsyonu eklendi ve 30 dakika sonra ELX808 iu<br />
Ultramicroplate reader kullanılarak 450 nanometredeki her bir kuyucuğun<br />
absorbans değeri saptandı ve pg/ml cinsinden hesaplandı.<br />
32
Change language