T.C. Süleyman Demirel Üniversitesi Tıp Fakültesi Enfeksiyon ...
T.C. Süleyman Demirel Üniversitesi Tıp Fakültesi Enfeksiyon ...
T.C. Süleyman Demirel Üniversitesi Tıp Fakültesi Enfeksiyon ...
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
4.3.5. Hasta ve kontrol grubu serum örneklerinde ELISA yöntemi ile IL-10<br />
düzeyinin belirlenmesi:<br />
Kit içerisindeki maddeler kullanmadan önce oda ısısında 30 dakika<br />
bekletildi. Kit içindeki liyofilize komponentlerin çözünmesinden sonra 10<br />
dakika daha beklendi. Yıkama için kullanılacak solüsyon 950 ml distile su ile<br />
karıştırılarak, 1/20 oranında dilüe edildi. Standart solüsyon şişe üzerindeki<br />
belirtilen distile su miktarı ile karıştırılarak, 20 ng/ml stok standart solüsyon<br />
elde edildi. Stok standart solüsyondan ve/veya dilüsyon sıvısından uygun<br />
miktarda kullanılarak 2000 pg/ml, 400 pg/ml, 80 pg/ml, 16 pg/ml, 0 pg/ml<br />
dilüsyonlarında plastik tüplere seri dilüsyonları elde edildi.<br />
Tablo 6. IL-10 seri dilüsyonlarının hazırlanması<br />
Standart konsantrasyon IL-10 Dilüsyon sıvısı<br />
2000pg/ml 50µlt 20ng/ml standart solüsyon 450µlt<br />
400pg/ml 100µlt 2000 pg/ml standart<br />
solüsyon<br />
400µlt<br />
80pg/ml 100µlt 400 pg/ml standart<br />
solüsyon<br />
400µlt<br />
16 pg/ml 100µlt 80 pg/ml standart 400µlt<br />
0pg/ml<br />
solüsyon<br />
400µlt<br />
96 kuyucuk içeren plak üzerinde her bir kuyucuğa 50 µlt standart veya<br />
serum örneklerinden konuldu. Plak 18-20 ºC’de oda ısısında inkübe edildi.<br />
Daha sonra ELX50 Auto Strip Washer ile kuyucuklar üç kez yıkandı. Üçüncü<br />
yıkama sonrasında kuyucuklar içindeki solüsyonun tamamen aspire edilmiş<br />
olduğuna dikkat edildi. Daha sonra her bir kuyucuğa kit içerisinde<br />
bulunan 50 µlt biotinile edilmiş antikor ve 100 µlt streptavidin-peroksidaz<br />
konjugat solüsyonundan eklendi ve plak tekrar 30 dakika 18-20ºC’de bekletildi.<br />
Bir sonraki aşamada kuyucuklar tekrar üç kez yıkama işlemine tabi tutuldu ve<br />
her bir kuyucuğa 100 µlt substrat solüsyonundan eklendi. 15 dakika boyunca<br />
oda ısısında tekrar inkübasyon sağlandıktan sonra, her bir kuyucuğa 50 µlt stop<br />
solüsyonundan eklendi 450 nanometrede her kuyucuğun absorbans değerleri<br />
pg/ml cinsinden hesaplandı.<br />
33
Change language