T.C. Süleyman Demirel Üniversitesi Tıp Fakültesi Enfeksiyon ...
T.C. Süleyman Demirel Üniversitesi Tıp Fakültesi Enfeksiyon ...
T.C. Süleyman Demirel Üniversitesi Tıp Fakültesi Enfeksiyon ...
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
olduğuna dikkat edildi. Daha sonra her bir kuyucuğa 100 µlt streptavidinperoksidaz<br />
solüsyonu eklendi. Plak tekrar folyo ile üstü kapatılarak oda ısında<br />
30 dakika bekletildi. Bir sonraki aşamada kuyucuklar içindeki solüsyon tekrar<br />
dört kez yıkandı ve dördüncü yıkama sonrasında solüsyonun tamamen aspire<br />
edilmiş olduğu görüldü. Her bir kuyucuğa 100 µlt kromojen solüsyonu eklendi<br />
ve kuyucuklar içindeki sıvının mavi bir renk aldığı gözlendi. Daha sonra plak<br />
oda ısısında ve karanlıkta 30 dakika inkübe edildi. Son olarak her bir kuyucuğa<br />
100 µlt stop solüsyonu eklendi ve ELX808 iu Ultramicroplate Reader ile, 450<br />
nanometrede her bir kuyucuğun absorbans değerleri saptandı pg/ml olarak<br />
hesaplandı.<br />
4.3.3. Hasta ve kontrol grubu serum örneklerinde ELISA yöntemi ile IL-6<br />
düzeyinin belirlenmesi:<br />
Kit içerisindeki maddeler kullanmadan önce oda ısısında 30 dakika<br />
bekletildi. Kit içindeki liyofilize komponentlerin çözünmesinden sonra 10<br />
dakika daha beklendi. Yıkama için kullanılacak solüsyon 950 ml distile su ile<br />
karıştırılarak, 1/20 oranında dilüe edildi. Liyofilize kontrol serum şişe<br />
üzerindeki distile su miktarı ile dilüe edildi. Liyofilize konjugat şişe üzerindeki<br />
distile su miktarı ile dilüe edildi. Substrat solüsyonu kullanmadan 10 dakika<br />
öncesinde şişe üzerindeki distile su ile dilüe edildi. Liyofilize standart solüsyon<br />
şişe üzerindeki belirtilen distile su miktarı ile karıştırılarak, 10 ng/ml standart<br />
solüsyon elde edildi. Tablo 4’de gösterildiği gibi standart solüsyondan ve<br />
dilüsyon sıvısından, uygun miktarlarda kullanılarak 1000 pg/ml, 333 pg/ml, 111<br />
pg/ml, 37 pg/ml, 12,3 pg/ml dilüsyonlarında plastik tüplere seri dilüsyonları<br />
elde edildi.<br />
Tablo 4. IL-6 seri dilüsyonlarının hazırlanması<br />
Standart konsantrasyon IL-6 Dilüsyon sıvısı<br />
1000pg/ml 50µlt 10ng/ml standart solüsyon 450µlt<br />
333pg/ml 150µlt 1000pg/ml standart 300µlt<br />
solüsyon<br />
111pg/ml 150µlt 333pg/ml standart 300µlt<br />
37pg/ml<br />
solüsyon<br />
150µlt<br />
solüsyon<br />
111pg/ml standart 300µlt<br />
12,3pg/ml 150µlt<br />
solüsyon<br />
37pg/ml standart 300µlt<br />
0pg/ml 300µlt<br />
96 kuyucuk içeren plak üzerinde her bir kuyucuğa 100 µlt standart veya<br />
serum örneklerinden ve 100 µlt konjugat konuldu. Plak 18-20 ºC’de oda ısısında<br />
inkübe edildi. Daha sonra ELX50 Auto Strip Washer ile kuyucuklar üç defa<br />
yıkandı. Üçüncü yıkama sonrasında kuyucuklar içindeki solüsyonun<br />
tamamen aspire edilmiş olduğuna dikkat edildi. Daha sonra her bir kuyucuğa<br />
200 µlt substrat solüsyonu eklendi. Plak ikinci kez anlatıldığı şekilde oda<br />
ısısında ve karanlıkta 30 dakika inkübe edildi. Son olarak her bir kuyucuğa 50<br />
µlt stop solusyunu konularak, ELX808 iu Ultramicroplate Reader ile, 405<br />
nanometrede her bir kuyucuğun absorbans değerleri saptandı ve pg/ml olarak<br />
hesaplandı.<br />
31
Change language