Anhang i. Simulationsmodell - FG Mikroelektronik, TU Berlin

vi.Patch-Anleitung
Anhang 146
Patch-Anleitung
(1) Chip in Sockel einsetzen. Erdung, Flow-Zu- und Abfluß justieren. Schale mit
extrazellulärer Lösung füllen.
(2) Chip mit Objektiv 1 scharfstellen.
(3) Mit Pipette ein bis zwei Tropfen Zellemulsion auf den Chip tropfen und Zellen
absetzen lassen.
(4) Schmutz und Kraftbrühe mit mind. 10ml extrazellulärer Lösung wegspülen.
Die Kraftbrühe verhindert einen guten Seal.
(5) Zelle aussuchen: Am besten eine Zelle wählen, die direkt auf einem Transistor
liegt. Sonst möglichst eine Zelle aussuchen, die sich beim Spülen noch
lange verschoben hat. Langsames Zucken der Zelle ist unproblematisch. Die
Zelloberfläche sollte keine sehr stark ausgeprägte „Maiskolben-Struktur“
haben.
(6) Zelle mit Objektiv 2 und anschließend mit Objektiv 3 scharfstellen.
(7) Pipette mit intrazellulärer Lösung füllen. Erst von unten über Kapillarwirkung,
dann mit Kanüle von oben, Luftblasen herausklopfen.
(8) Flow-Zu- und Abfluß entfernen.
(9) Pipette einsetzen, mit Objektiv 1 scharfstellen und senkrecht ausrichten.
(10) Überdruck auf Pipette geben (ca. 15cm Wassersäule)
(11) Patch-Clamp-Verstärker auf VC-Search stellen. Testimpuls (10ms, 10mV)
einstellen.
(12) Pipette in Elektrolyten eintauchen.
(13) Pipettenwiderstand bestimmen. Offset abgleichen. Gute Pipetten für Herzmuskelzellen
liegen zwischen 1,7 und 2,2MΩ; auf VC umstellen.
(14) Pipettenschaft mit Objektiv 1 und anschließend mit Objektiv 2 Pipettenöffnung
scharfstellen.
(15) Pipette absenken und Schärfe nachstellen.
(16) Zu Objektiv 3 wechseln und Pipette weiter absenken.
(17) Pipette so weit auf die Membran der Zelle absenken bis sie sich deutlich eindellt
und der Widerstand um 3-4MΩ angestiegen ist. Letztes Heranfahren mit
langsamster Geschwindigkeit.
(18) Druck ablassen und ca. 10cm Wassersäule Unterdruck geben.
(19) Sealen abwarten. Verstärkung nachstellen (am Verstärker und in der Software).
(20) Ab 100MΩ Haltespannung langsam verkleinern.
(21) Vor dem Durchreißen der Membran muß die Haltespannung bei -80mV liegen.
(22) Durchreißen der Membran: Ohne Wassersäule 5ml Spritze durchziehen.
Wenn die Membran durchreißt, übersteuert der Verstärker. Verstärkung auf
Gain 1 zurückstellen und auf CC-fast umschalten. Protokoll zu CC wechseln.
(23) Wenn der Seal gut ist, wird die Zelle bei -70 bis -80mV geklemmt, sonst
leicht negativen Haltestrom einstellen.
(24) Stimulationsimpuls geben. Stromimpuls schrittweise erhöhen, bis Aktionspotential
ausgelöst wird. Dann Impulslänge verkleinern.
(25) Transistor auswählen: Liegt die Zelle schon auf dem richtigen Transistor,
muß unbedingt der Transistor vor dem Patchen eingeschaltet werden, sonst
wird die Zelle durch Wackeln zerstört. Muß die Zelle umgesetzt werden,
Transistor einschalten, sobald die Zelle angehoben ist.
(26) Umsetzen der Zellen: Pipette mit langsamster Geschwindigkeit anheben,
dabei leicht diagonal nach oben ziehen; dann Chip unter der Pipette verschieben.
Zelle über Transistor absenken.
(27) Bei den Messungen muß das Licht ausgeschaltet werden (Fotoeffekt).