Untersuchung des Einflusses von Maservirus auf ... - OPUS Würzburg

______________________________- 33 -_____________________________
Herstellung der AET-SRBC-Lösung
10 Flaschen SRBC wurden in 50 ml Röhrchen zentrifugiert (2000 rpm, 7 min, RT), anschließend
wurden je vier Pellets in Alsevers resuspendiert, mit Alsevers auf 50 ml aufgefüllt
und erneut zentrifugiert (2000 rpm, 7 min, RT). Das SRBC-Pellet wurde mit AET-Lösung
versetzt und für 20 min im 37°C-Wasserbad inkubiert. Anschließend wurde die SRBC-
Lösung mit kaltem PBS auf 50 ml aufgefüllt und zentrifugiert (1500 rpm, 10 min, RT). Der
Waschschritt wurde zweimal wiederholt. Die gewaschenen Pellets, je ca. 2 ml SRBC-Lösung,
wurden in 48 ml RPMI/10 % FKS resuspendiert, wodurch sich eine 4 %ige AET-SRBC-
Lösung ergibt. Die Lösungen wurden bis zum Verbrauch bei 4°C aufbewahrt und vor jeder
Leukapherese frisch angesetzt.
Erythrozyten-Lyse-Puffer
155 mM NH 4 Cl
10 mM KHCO 3
0.1 mM EDTA
Percolldichtegradient
Ein Percoll-Dichtegradient wurde mit Percoll einer Stammkonzentration von 1,129 g/ml (von
der Firma Amersham Biosciences) nach folgendem Schema hergestellt:
für 10 ml 1.076 g/ml: 1 ml 1.5 M NaCl + 5.442 ml Percoll + 3.558 ml aqua dest.
für 10 ml 1.059 g/ml: 1 ml 1.5 M NaCl + 4.124 ml Percoll + 4.876 ml aqua dest.
für 10 ml 1.045 g/ml: 1 ml 1.5 M NaCl + 3.039 ml Percoll + 5.961 ml aqua dest.
3.7. Western Blot
Blockierungspuffer
3 % w/v BSA in PBS
5 % w/v fettarmes Milchpulver in PBS/0.05 % Tween-20
Waschpuffer
PBS/0.05 % Tween-20