Untersuchung des Einflusses von Maservirus auf ... - OPUS Würzburg

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eine geeignete Menge Kulturmedium (RPMI/10 % FKS) aufgenommen und in einer Kulturflasche
kultiviert. Die aufgetauten T-Zellen wurden nicht länger als 3 Tage verwendet.
4.2. Virologische Methoden
Die eingesetzte MOI (multiplicity of infection), welche die Anzahl infektiöser Partikel pro
Zelle angibt, wurde wie folgt berechnet und ist an entsprechender Stelle vermerkt:
Einzusetzende Virusmenge [ml] = MOI x Zellzahl [ml]
TCID 50 [ml]
4.2.1. Zucht des MV Vakzinestammes ED
Zur Virusanzucht wurden Vero-Zellen am Vortag mit warmen ATV abgelöst und in 10 250
ml Kulturflaschen mit einer Dichte von 1x10 7 /Kulturflasche in MEM/5 % FKS ausgesät.
Nachdem sich ein konfluenter Zellrasen gebildet hatte, wurde das Kulturmedium entfernt, die
Zellen wurden einmal mit MEM ohne FKS gewaschen und mit ED mit einer MOI von 0.01 in
MEM-Medium ohne FKS infiziert und für eine Stunde im Brutschrank bei 37°C belassen.
Nach beendeter Inkubation wurde das Inokulum entfernt, vollständiges Kulturmedium
hinzugefügt und für 3-4 Tage in einen Brutschrank mit einer Temperatur von 33°C kultiviert
bis sich ein ausgeprägter zytopathischer Effekt entwickelte. Danach wurde das Kulturmedium
entfernt, 5 ml steriles PBS/Flasche hinzugefügt und über Nacht bei -20°C eingefroren. Am
folgenden Tag wurden die Zellen rasch aufgetaut und durch Klopfen vom Kulturflaschenboden
abgelöst. Die Zelltrümmer wurde in 50 ml Zellkulturröhrchen überführt und
für 15 min bei 3000 rpm, 4°C zentrifugiert. Der Virus-haltige Überstand wurde in ein neues
Röhrchen überführt, auf Eis gestellt und anschließend rasch in Einfrierröhrchen aliqoutiert
und bei -80°C gelagert.