Untersuchung des Einflusses von Maservirus auf ... - OPUS Würzburg

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4.3.10. Transfektion von primären T-Zellen
Zur Transfektion von primären T-Zellen wurde der Amaxa Nucleofector kit nach dem
empfohlenem Protokoll verwendet. Dafür wurden T-Zellen am Vortag aufgetaut. Zur Vorbereitung
wurden die zu transfizierende Plasmid-DNA Aktin-eGFP (p4010, Clontech), die T-
Zell-spezifische Nucleofector-Lösung für 30 min bei RT und 3 ml Kulturmedium
(RPMI/10% FKS) im Brutschrank erwärmt. Pro Transfektion wurden 1x10 7 T-Zellen in
einem 15 ml Röhrchen pelletiert (5 min, 1600 rpm, 24°C), das Medium vollständig abgesaugt
und das Zellpellet mit 100 µl Nucleofector -Lösung resuspendiert. Anschließend wurde 10
µg Plasmid-DNA hinzugefügt und vorsichtig gemischt. Der Ansatz wurde luftblasenfrei in die
zertifizierte Amaxa-Küvette überführt und das T-Zell-spezifische Programm U-14 gewählt.
Die transfizierten T-Zellen wurden in 37°C warmen Kulturmedium (RPMI/10% FKS)
aufgenommen und 24 h nach der Transfektion für die mikroskopische Analyse eingesetzt.
4.3.11. Live cell imaging
Persistierend ED-infizierte U251p-Zellen wurden am Vortag mit einer Zelldichte von
1x10 5 /Kammer in 500 µl Kulturmedium (RPMI/5% FKS) in 8-Kammerdeckgläser (LabTek
chamber slice) ausgesät. Zur Kontrolle wurden nicht-infizierte U251-Zellen ausgesät. Vor der
Analyse wurden die Zellen einmal mit 500 µl Kulturmedium gewaschen und 200 µl RPM/5
% FKS/FIP/Hepes pro Kammer zugegeben. Um eine bessere Pufferwirkung zu erzielen
wurde das Medium mit 25 mM Hepes pH 7.4 supplementiert. Aktin-eGFP-transfizierte T-
Zellen wurden pelletiert (5 min, 1600 rpm, 24°C), in RPMI/5 % FKS/FIP/Hepes resuspendiert
und bis zur Analyse im Brutschrank gehalten. Für jede Analyse wurden 100 µl 4x10 5 T-
Zellen frisch zu U251-Zellen hinzugefügt und die Kammer sofort mittels konfokalem
Mikroskop analysiert. Zusätzlich wurde ein Objekttischheizer und Objektivheizung (von
Zeiss) eingesetzt, mit dem die Zellen bei 37°C gehalten werden konnten.