Untersuchung des Einflusses von Maservirus auf ... - OPUS Würzburg

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Medium entnommen, 3 x mit 100 µl/well warmen Assaypuffer gewaschen und die verbliebenen
adhärenten Zellen mit dem Fluoroscan Acent gemessen.
4.3.9. Generierung von dendritischen Zellen (MoDC) aus primären Monozyten –
Analyse der DC/T-Zell-Konjugatbildung
Zur Generierung von dendritischen Zellen wurden Monozyten wie im Abschn. 4.1.6.
erwähnt, aufgetaut und in einer 6-well-Platte in einer Zelldichte von 1.5x10 6 /well in 3 ml
RPMI/10 % FKS ausgesät. Dem Medium wurde 500 U/ml GM-CSF und 250 U/ml IL-4
hinzugefügt. Jeden zweiten Tag wurde das Medium erneuert und mit frischen Wachstumsfaktoren
versetzt. Am Tag 6 wurden die so erhaltenen unreifen DC durch Zugabe von 100
ng/ml LPS ausgereift. Die ausgereiften DC wurden am Tag 7-8 für Experimente eingesetzt.
Zur Analyse der DC/T-Zell-Konjugatbildung wurden T-Zellen in Medium mit WTF mit einer
MOI von 1 (RPMI/0.5 % FKS/FIP) für 2h, 4°C inkubiert. Die Zellen wurden pelletiert (1 min,
6000, rpm, 4°C), in Medium (RPMI/0.5 % FKS/FIP) resuspendiert und auf eine Zellkonzentration
von 2x10 5 /100 µl eingestellt. In der Zwischenzeit wurden 8-Kammerobjektträger
(LabTekII) mit 200 µl/Kammer Poly-L-Lysin (0.01 % in sterilem aqua dest.)
für 10 min bei RT beschichtet, anschließend 3 x mit je 500 µl PBS gewaschen. Die
Objektträger wurde vor der Verwendung für einige Minuten im Brutschrank erwärmt. Die
LPS-gereiften MoDC wurden 5 min, 1200 rpm, 24°C zentrifugiert, in Medium (RPMI/0.5 %
FKS/FIP) resuspendiert und auf eine Zellmenge von 0.5x10 5 /100 µl eingestellt. Zur Beladung
des MHCII-Rezeptors wurden 1 µg/ml SEA und 1 µg/ml SEB hinzugefügt, vorsichtig
gemischt und für 15 min im Brutschrank inkubiert. Anschließend wurden je 100 µl MoDC
pro Kammer hinzugefügt und für weitere 15 min im Brutschrank adhäriert. Zur T-Zell-
Suspension wurde ebenfalls 1 µg/ml SEA und 1 µg/ml SEB zugegeben und 100 µl T-
Zellen/Kammer zu den MoDC gegeben, womit sich ein DC/T-Zell-Verhältnis von 1:4 ergab.
Die Konjugatbildung wurde für 20-25 min im Brutschrank durchgeführt. Danach wurden
vorsichtig 100 µl des Mediums entfernt, unmittelbar 500 µl 4% PFA zugefügt und die Zellen
für 10 min bei RT fixiert. Die Immunfluoreszenzfärbung wurde wie im Abschn. 4.3.6.
fortgeführt.