Untersuchung des Einflusses von Maservirus auf ... - OPUS Würzburg
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Kaninchen Anti-Maus HRP<br />
Ziege Anti-Kaninchen HRP<br />
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1:10 000 in Milch/PBS<br />
1:2000 in Milch/PBS<br />
Proteindetektion<br />
Die Membran wurde mit Chemilumineszenzsubstrat (ECL) im Verhältnis 1:1 für 1 min bei<br />
RT inkubiert, überschüssige ECL-Lösung entfernt, die Membran in einer Filmkassette<br />
verschlossen und sofort im Dunkelraum <strong>auf</strong> einen Röntgenfilm für 1-5 min exponiert.<br />
Densiometrische Auswertung<br />
Die Signalintensität <strong>von</strong> WB-Banden wurde mit AIDA Programm, Version 4 (Raytest<br />
Isotopenmeßgeräte) ermittelt und ausgewertet.<br />
4.3.2. Virusbindung an T-Zellen<br />
Zur Bindung <strong>von</strong> WTF (oder ED) an T-Zellen wurden die Zellen zentrifugiert (5 min, 1600<br />
rpm, 24°C) und in einer geeigneten Zelldichte in RPMI/1 % FKS resuspendiert. Um die<br />
Aufnahme viraler Partikel zu verhindern wurde zusätzlich FIP (200 µM) zugesetzt. Durch<br />
Gradienten-Ultrazentrifugation gereinigtes Virus (Abschn. 4.2.3.) wurde <strong>auf</strong> Eis <strong>auf</strong>getaut<br />
und in einer MOI <strong>von</strong> 1 vorsichtig mit den Zellen gemischt. Danach wurde der Ansatz für 2<br />
Stunden im 4°C-Kaltraum <strong>auf</strong> einem Rotator inkubiert, um eine gleichmäßige Durchmischung<br />
zu gewährleisten. Anschließend wurden die Zellen pelletiert (1 min, 6000 rpm,<br />
4°C), in RPMI/1 % FKS/FIP resuspendiert und je nach Assay <strong>auf</strong> 1x10 5 /100 µl, 1x10 6 /100 µl<br />
oder 1x10 7 /ml Medium eingestellt und wie unten beschrieben fortgefahren.
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