Untersuchung des Einflusses von Maservirus auf ... - OPUS Würzburg

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4.1.5. Reinigung von primären humanen Lymphozyten mittels Leukapherese
Isolierung von PBMC
Bei der Isolation von periphere Blutlymphozyten durch Zentrifugation über einen Ficoll-
Hypaque-Dichtegradienten, wird die Trennung von mononukleären Zellen und anderen
Komponenten des Blutes aufgrund ihrer unterschiedlichen Dichte genutzt. Aufgrund höherer
Dichte lagern sich Erythrozyten, polymorphkernige Leukozyten (basophile, eosinophile und
neutrophile Zellen) und Granulozyten im Zentrifugationsrückstand als Pellet an. Die weniger
dichten mononukleären Zellen (PBMC) wie Lymphozyten (B- und T-Lymphozyten), NK-
Zellen und Monozyten sammeln sich als Interphase oberhalb der Ficollschicht (Schema 4.1.).
Plasma/Thrombozyten
Lymphozyten
Ficoll
Granulozyten/Erythrozyten
Schema 4.1.: Isolation von Blutkomponenten über einen Ficoll-Hypaque-Gradienten.
Humane PBMC wurden aus dem Blut gesunder Spender isoliert. Dazu wurde heparinisiertes
Blut im Verhältnis 1:2 mit Versen verdünnt und in 50 ml Röhrchen in Portionen von 30 ml
auf 9 ml Ficoll vorsichtig überschichtet und durch Zentrifugation aufgetrennt (1200 rpm, 30
min, RT, ohne Bremse). Die Interphase oberhalb des Ficoll wurde mit einer Pasteurpipette
abgesaugt, in 50 ml Röhrchen verteilt, mit PBS aufgefüllt und zentrifugiert (1200 rpm, 10
min, RT). Zum Ausdünnen des mitgeführten Ficolls wurde der Waschschritt zweimal
wiederholt. Vor dem letzten Waschschritt wurden 200 µl als Probe für eine FACS-Färbung
und zur Bestimmung der Zellzahl entnommen. Circa 1/3 der PBMC wurden in kaltes
Einfriermedium mit einer Zellzahl von 5x10 7 /Röhrchen in Einfrierboxen eingefroren und bei -
80°C aufbewahrt. Die restlichen 2/3 der PBMC-Fraktion wurden zur Isolation von Monozyten
und T-Zellen eingesetzt.