Prof. Th. Scheper Institut für Technische Chemie Bioprozesstechnik ...

Prof. Th. Scheper
Institut für Technische Chemie
Inhalt
Vorlesungsskript (erstellt in Zusammenarbeit mit Prof. R. Ulber, Dr. Lars Kreye, Dr. Chr. Schippers)
Bioprozesstechnik (Stand April 2005)
(Fehler und Änderungwünsche bitte an scheper@iftc.uni-hannover.de)
1. DEFINITION .................................................................................................................................................... 3
2. SEIT WANN GIBT ES DIE BIOTECHNOLOGIE ? ................................................................................... 3
3. EIN WENIG MIKROBIOLOGIE .................................................................................................................. 3
3.1 VON DEN KLEINSTEN DER KLEINEN .............................................................................................................. 4
3.2 DIE ZWEI ZELLTYPEN .................................................................................................................................... 5
3.3. DIE VERSCHIEDENEN GRUPPEN DER PROKARYONTEN.................................................................................. 7
Bacteria ......................................................................................................................................................... 7
Archaea ....................................................................................................................................................... 10
3.4. DIE VERSCHIEDENEN GRUPPEN DER EUKARYONTEN.................................................................................. 11
Pilze............................................................................................................................................................. 11
Algen und Protozoen ................................................................................................................................... 17
Tierische und pflanzliche Zellkulturen ........................................................................................................ 19
3.5. MIKROBIELLES WACHSTUM ...................................................................................................................... 19
Welche Faktoren beeinflussen die Biomasseproduktion in einem Bioreaktor? .......................................... 19
Wachstumstypen .......................................................................................................................................... 21
Mikrobieller Stoffwechsel............................................................................................................................ 22
4. PROZEßTECHNIK........................................................................................................................................ 26
4.1. REAKTORTYPEN ......................................................................................................................................... 26
Grundtypen: ................................................................................................................................................ 26
Spezielle Reaktortypen: ............................................................................................................................... 26
Arbeitsweise................................................................................................................................................. 27
4.2BESCHREIBUNG VON REAKTOREN................................................................................................................ 27
4.3. IDEALE REAKTOREN................................................................................................................................... 28
Idealer Satzreaktor (Rührkesselreaktor, batch reactor).............................................................................. 28
Ideales Strömungsrohr (plug flow reactor)................................................................................................. 28
Idealer Durchflußrührkessel (continuous stirred tank reactor) .................................................................. 29
4.4. REALE REAKTOREN.................................................................................................................................... 30
5. WACHSTUM IM BIOREAKTOREN.......................................................................................................... 30
5.1. KINETIK DES WACHSTUMS......................................................................................................................... 30
5.2. UNGEHINDERTES WACHSTUM.................................................................................................................... 31
5.3 REALES WACHSTUM ................................................................................................................................... 31
5.4. ZELLWACHSTUM UND PRODUKTBILDUNG .................................................................................................. 33
Substratverbrauchsraten ............................................................................................................................. 33
5.5. PRODUKTBILDUNG ..................................................................................................................................... 34
Einteilung nach GADEN ............................................................................................................................... 34
6. MODELLE ...................................................................................................................................................... 37
6.1. NICHTSTRUKTURIERTE, VERTEILTE MODELLE ........................................................................................... 37
6.2. STRUKTURIERTE MODELLE ........................................................................................................................ 38
6.3. DAS MONOD-MODELL................................................................................................................................39
6.4. WACHSTUM IM GERÜHRTEN SATZREAKTOR............................................................................................... 40
6.5. WACHSTUM IM CSTR ................................................................................................................................ 41
7. ZELLRÜCKHALTUNG................................................................................................................................ 43
7.1. INNERER FILTER ........................................................................................................................................ 43
7.2. SEDIMENTATION......................................................................................................................................... 44
7.3. TRENNEINHEIT (ÄUßERER FILTER, SEPARATION)........................................................................................ 45

Einführung in die Biotechnologie - 2 - Scheper, TCI Hannover
8. BEGASUNG VON BIOKOMPONENTEN UND SAUERSTOFFÜBERTRAGUNG ............................. 46
9. GRUNDOPERATIONEN FÜR DEN BIOPROZEß ................................................................................... 48
10. AUFARBEITUNG UND ISOLIERUNG VON PRODUKTEN................................................................ 48
10.1. FILTRATION.............................................................................................................................................. 51
10.2. ZENTRIFUGATION..................................................................................................................................... 52
10.3. ZELLAUFSCHLUSS .................................................................................................................................... 52
10.4. CAPTURESCHRITT..................................................................................................................................... 52
10.5. CHROMATOGRAPHIE ................................................................................................................................52
10.7. MATHEMATISCHE BESCHREIBUNG DER CHROMATOGRAPHIE................................................................... 55
11. BIOPROZESSANALYTIK.......................................................................................................................... 57
12. ENZYMKINETIK ........................................................................................................................................ 62
12.1 ALLGEMEINES ........................................................................................................................................... 62
12.2. HERSTELLUNG.......................................................................................................................................... 63
12.3. EINSATZ ................................................................................................................................................... 63
12.4. ENZYMKINETIK ........................................................................................................................................ 64
12.5 ABWEICHUNGEN VOM MICHAELIS-MENTEN-MODELL .............................................................................. 67
12.6. ENZYMIMMOBILISIERUNG ........................................................................................................................ 68
Immobilisierung durch Kupplung: .............................................................................................................. 68
Immobilisierung durch Einschluß ............................................................................................................... 69
12.7 KINETIK IMMOBILISIERTER ENZYME ......................................................................................................... 70
12.8 BEIPIELE FÜR ENZYMREAKTOREN............................................................................................................. 72
Typ Satzreaktor............................................................................................................................................ 72
Festbettreaktor ............................................................................................................................................ 73
Festmembranreaktoren ............................................................................................................................... 75
Industrieller Prozeß..................................................................................................................................... 76
13. TECHNISCHE ANWENDUNGEN ............................................................................................................ 79
13.1. STÄRKEVERZUCKERUNG .......................................................................................................................... 79
13.2 PENICILLIN................................................................................................................................................ 80
13.3 INDUSTRIELLE NUTZUNG GANZER ZELLEN................................................................................................ 81
Aceton-Butanol-Gärung .............................................................................................................................. 81
Backhefe aus Saccharomyces cerevisiae..................................................................................................... 82

Einführung in die Biotechnologie - 3 - Scheper, TCI Hannover
1. Definition
DECHEMA-Definition: Einsatz biologischer Prozesse im Rahmen technischer
Verfahren und industrieller Produktionen
Biotechnologie kann als anwendungsorientierte Wissenschaft der Mikrobiologie, Biochemie
und Molekularbiologie in enger Verbindung mit anderen Naturwissenschaften (z.B.
Technische Chemie, Ingenieurwissenschaften, Physik, Mathematik) gesehen werden.
Reaktionen mit: lebenden Mikroorganismen
pflanzlichen Zellen
tierischen Zellen
ruhenden Zellen/ Gewebe
Zellteilen
Enzymen
weitere Anwendung: Landwirtschaft, medizinische Technik, Umwelttechnik
2. Seit wann gibt es die Biotechnologie ?
I) Empirische Biotechnologie:
7000 v.Chr. Bierbrauen (Babylonien)
Biotechnologische Verfahren und Produkte bis zur Zeitwende:
- Sauerteig (Brot)
- alkoholische Gärung (Wein)
- Essigherstellung
- Käse
Erste industrielle Techniken im Mittelalter:
- Ethanolherstellung (Destillation)
- Ledergerberei
- technische Essigproduktion
- ab 19.Jh.: Milchsäureproduktion
II) Übergang zu technischer Mikrobiologie oder klassischer Biotechnologie:
- Darstellung von: - Butanol, Aceton (1915/16)
- Glycerin (1915/16)
- Zitronensäure (1920)
- Abwasserreinigung
- Backhefeherstellung
III) Moderne Biotechnologie, biochemical engineering:
Beginn: Entdeckung der Antibiotika
Entdeckung der Methoden der Gentechnik
3. Ein wenig Mikrobiologie
Seitdem der niederländische Naturforscher Antony van Leeuwenhoek um 1700 nachweislich
die ersten Bakterien entdeckte, hat die Wissenschaft von den kleinen Lebewesen, die
Mikrobiologie, eine rasante Entwicklung mitgemacht. Dies war eine wichtige Voraussetzung
für die Biotechnologie.

Einführung in die Biotechnologie - 4 - Scheper, TCI Hannover
Im folgenden Kapitel sollen daher verschiedene, grundlegende mikrobiologische
Sachverhalte und Arbeitstechniken vorgestellt werden, um einen kurzen Einblick in dieses
Fachgebiet zu vermitteln. Biotechnologische Aspekte werden dabei ebenfalls berücksichtigt.
3.1 Von den Kleinsten der Kleinen
In der Natur gibt es eine Vielzahl von Lebensformen, die sich in der Regel einer der drei
folgenden Gruppen zuordnen lassen.
Die normalerweise unbeweglichen Pflanzen zeichnen sich durch ihre Fähigkeit aus,
Sonnenlicht zum Aufbau körpereigener Substanzen nutzen zu können. Hierzu gehören der bis
zu 120 m hoch werdende Mammutbaum (Sequoia) als auch winzig kleine Vertreter, die zum
Teil nicht größer als 0,02 mm sind. Sie alle synthetisieren aus anorganischen Stoffen
organische Substanz, weshalb sie auch Produzenten genannt werden. Die Erforschung dieser
Lebewesen ist Gegenstand der Botanik.
Durch wesentlich komplexere Bewegungs- und Sinnesleistungen zeichnen sich
demgegenüber die Tiere aus. Sie bauen als sogenannte Konsumenten die von den Pflanzen
gebildete organische Substanz wieder unter Energiegewinn um oder ab. Zu dieser Gruppe
gehören Vertreter wie der Blauwal, der mit einer Länge von 30 m das größte derzeit lebende
Säugetier ist. Aber auch winzig kleine Organismen wie die einzelligen Protozoen gehören
dazu, die minimale Ausmaße von etwa 0,01 mm erreichen können. Das Studium der Tiere
bildet das Arbeitsfeld der Zoologie.
Irgendwann muß die organische Substanz, die in Pflanzen und Tieren festgelegt ist, wieder
in die anorganischen Bausteine zerlegt, d. h. mineralisiert werden. Dies wird durch die
Destruenten geleistet. In erster Linie werden hierzu Bakterien und Pilze gezählt, die,
zusammen mit den Viren, im Fachgebiet der Mikrobiologie bearbeitet werden (s. Abb. 3.1).
Die Mikrobiologie stellt also die Lehre des Lebens mikroskopisch kleiner Objekte dar (logos
(griech.) Vernunft, Begriff / (bios (griech.) Leben-, das Leben betreffend). Je nach
Untersuchungsobjekt wird diese Wissenschaft noch weiter unterteilt in Bakteriologie,
Mykologie („Pilzkunde“) und Virologie. In den Grenzbereich zu anderen biologischen
Richtungen fallen die Algologie und die Protozoologie. Schon sehr früh wurden diese
Organismen unter dem Sammelbegriff Protisten zusammengefaßt. Protisten weisen eine
geringere morphologische Differenzierung als Pflanzen und Tiere auf und sind meistens einzellig.
Viren sind nicht-zelluläre Teilchen, können sich nur mit Hilfe fremder Zellen vermehren
und unterscheiden sich dadurch von den Organismen. Abb. 3.2 gibt die
Größenverhältnisse zwischen Zellen, Viren und Sporen im Vergleich mit einem menschlichen
Haar wieder.

Einführung in die Biotechnologie - 5 - Scheper, TCI Hannover
Objekte der
5µm
tierische Zelle
Pilze
Hefezelle
Hyphe
Spore
Zellkern
Bakterien
Kokken
Stäbchen
Botanik Zoologie Mikrobiologie
Abb. 3.1: Objekte verschiedener
Fachrichtungen der
Biologie
menschliches Haar
Abb. 3.2:
Mikrobiologie
Größenverhältnisse in der
Virus
Die vergleichbaren Virusausmaße
entsprechen in etwa dem eines Punktes
des Musters!
.
Mikroorganismen sind überall: im Boden, im Wasser und in der Luft, in Gebäuden, an und
in Pflanzen und Tieren. Ein Mensch beherbergt z. B. etwa 10mal so viele Keime, wie er
körpereigene Zellen hat. Bei Vorliegen von „günstigen“ Verhältnissen können
Mikroorganismen in bestimmten Fällen Krankheiten verursachen, viel häufiger sind sie aber
für den Menschen nützlich. So helfen Darmbakterien bei der Verdauung der Nahrung; auf der
Haut angesiedelte Bakterien schützen vor Fremdinfektionen.
3.2 Die zwei Zelltypen
Alle Organismen lassen sich differenzieren in Pro- oder Eukaryonten (synonym:
-karyoten). Karyon bedeutet Kern.
Pro- (lat.) bedeutet Vor- ... Prokaryonten sind also die Organismen mit einem „Vorkern“, d.
h. sie haben einen ringförmig geschlossenen DNA-Strang, der frei im Cytoplasma liegt. Das
Cytoplasma stellt dabei eine wäßrige Lösung von Proteinen, Nukleinsäuren, Kohlenhydraten
und Ionen dar und wird von der Zellmembran umschlossen. Zu den Prokaryonten werden die
Bacteria und Archaea gezählt, auf die im folgenden noch näher eingegangen wird (s. Kap.
1.2).
Demgegenüber stehen die Eukaryonten (eu (griech.) gut); hier liegt die DNA in einem
echten, membranumschlossenen Zellkern vor. Hierzu gehören alle anderen Organismen, also
Pilze, Pflanzen und Tiere.
Die beiden Gruppen unterscheiden sich jedoch nicht nur bezüglich des Zellkerns, sondern
auch noch in anderen Bereichen. Die Tab. 1 gibt einen Überblick der grundlegenden
Unterscheidungsmerkmale wieder.

Einführung in die Biotechnologie - 6 - Scheper, TCI Hannover
Tab. 1: Gegenüberstellung der wichtigsten Unterschiede zwischen Pro- und Eukaryonten
Prokaryonten
DNA als ringförmig geschlossener Strang frei
im Cytoplasma („Bakterien-Chromosom“)
keine Organellen (→ membranumschlossene,
differenzierte Zellbestandteile spezieller Funktion)
kleine Ribosomen (70 S) (→ übersetzen die genetische
Information in Proteine)
morphologisch gering differenziert (Grundform:
Kugel oder gerade bzw. gekrümmte
Zylinder), dafür viele stoffwechselphysiologische
Besonderheiten (s. u. a. Kap. 1.4)
Eukaryonten
echter Zellkern mit Chromosomen
Organellen (u. a. Mitochondrien
(„Kraftwerke der Zelle“) und speziell
bei Pflanzen Chloroplasten (Ort der
Photosynthese))
große Ribosomen (80 S)
zunehmender Differenzierungsgrad von
Einzelzelle zum Organismus
In Abb. 3.3 sind zwei repräsentative Vertreter der beiden Gruppen dargestellt: die
Bakterienzelle für die Prokaryonten und die embryonale Pflanzenzelle für die Eukaryonten.
Poly-β-hydroxybuttersäure
Glykogeneinschluß
"Zellkern"
Plasmid
Ribosom
Geißel
a)
Nucleolus rauhes endoplasmatisches Reticulum
Zellkern Kernhülle Vakuole Dictyosom
b)
Fetttröpfchen
Polyphosphatgranula
Cytoplasma
Cytoplasmamembran
periplasmatischer Raum
Mureinschicht
äußere Membran
Lipidtröpfchen
Plasmodesmos Zellwand
Ribosom
Mittellamelle
Mitochondrium
Cytoplasmamembran
glattes endoplasmatisches Reticulum
Abb. 3.3: Gegenüberstellung einer pro- und einer eukaryontischen Zelle
a) Prokaryontische Zelle (am Beispiel: Bakterienzelle)
links: Präsentation einiger Zelleinschlüsse, artifiziell
rechts: Darstellung restlicher „normaler“ Zellbestandteile
b) Eukaryontische Zelle (am Beispiel: Pflanzenzelle)
Die Darstellung eines auch nur annähernd umfassenden Stammbaums aller Lebewesen würde
den Rahmen einer „Einführung in die Biotechnologie“ sprengen.
Hier soll daher nur eine stark vereinfachte Graphik eines Dendrogramms dargestellt werden,
das auf Basis von 16/18 S rRNA-Untersuchungen aufgestellt werden konnte. Die ribosomale
Ribonucleinsäure eignet sich hervorragend für solche Analysen, da sie gut isoliert und
analysiert werden kann. Zudem finden Veränderungen in bestimmten Bereichen der rRNA
mit der richtigen statistischen Häufigkeit statt. Die gewonnenen Daten lassen sich
anschließend z. B. per Computer vergleichsweise einfach auswerten und vergleichen. Der
dargestellte Stammbaum gibt die Dreiteilung der Lebewesen wieder. Je kleiner der Abstand
zwischen zwei Punkten, desto kleiner sind die Unterschiede in der Nukleinsäuresequenz, um
so größer ist also die Verwandtschaft. Eukaryonten (Eucarya) sind daher enger mit Archaea
verwandt, als mit den Bacteria. Das ganze Stammbaumsystem muß derzeit ständig verändert

Einführung in die Biotechnologie - 7 - Scheper, TCI Hannover
Bacteria
Eucarya
Archaea
Abb. 3.4: Stark simplifizierter,
auf Analyse der rRNA basierender
Stammbaum der
Lebewesen,
und er-weitert werden, da durch intensive
Forschungsarbeit und die Weiterentwicklung (bio-
)chemischer und physikalischer Methoden ständig
neue Organismen entdeckt und bereits bekannte
besser charakterisiert werden.
In den folgenden Kapiteln sollen die
verschiedenen Großgruppen der Mikrobiologie, also
Bacteria, Archaea und Pilze, aber ebenso die
Organismengruppen der Übergangsbereiche zu
anderen biologischen Disziplinen, nämlich Algen
und Protozoen, vorgestellt werden.
3.3. Die verschiedenen Gruppen der
Prokaryonten
So wie sich Pro- und Eukaryonten klar
voneinander unterscheiden lassen, so
kann innerhalb der Gruppe der
Prokaryonten wieder gut in Bacteria
und Archaea differenziert werden.
Bacteria
Die folgende Übersicht gibt eine Unterteilung nach Morphologie und GRAM-Färbbarkeit
wieder, die sich am Lehrbuch „ALLGEMEINE MIKROBIOLOGIE“ von H. G. Schlegel 1 orientiert.
(Zwei grundlegende Bücher für die Bestimmung von Prokaryonten sind „BERGEY’S MANUAL
OF DETERMINATIVE BACTERIOLOGY“ 2 und „BERGEY’S MANUAL OF SYSTEMATIC
BACTERIOLOGY“ 3 .) Die Unterteilung nach den beiden Aspekten Morphologie und GRAM-
Färbbarkeit heißt aber auch, daß innerhalb einer Gruppe stehende Organismen nicht
unbedingt nah verwandt sein müssen. Um ein Beispiel aus der Zoologie zu nennen: Sowohl
Haie als auch Delphine haben einen stromlinienförmigen Körper und Flossen, jedoch gehören
erstere zu den Knorpelfischen und damit zu einer erdgeschichtlich sehr alten Art, Delphine
dagegen sind Säugetiere, die sich wieder an das Leben im Wasser angepaßt haben. Für die
verschiedenen Gruppen sind in den meisten Fällen repräsentative Beispiele angegeben.
1. Kokken (Cocci), kugelförmige Bakterien
GRAM-positiv: Streptococcus, Staphylococcus
GRAM-negativ: Neisseria
2. Stäbchen, gestreckt zylinderförmige Bakterien
GRAM-positiv: Bacillus
GRAM-negativ: Pseudomonas, Escherichia, Serratia, Vibrio
3. Gekrümmte Stäbchen oder flexible Zellen
GRAM-positiv
GRAM-negativ: Spirillum
4. Große Sondergruppen
- gleitende Bakterien
1 Schlegel, H. G. (1992) Allgemeine Mikrobiologie. 7., überarbeitete Auflage unter Mitarbeit von
Christiane Zaborosch, Thieme, Stuttgart • New York
2 Buchanan, R. E.; Gibbon, N. E. (Herausgeber) (1974) Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology.
8. Aufl., Williams & Wilkins, Baltimore
3 Krieg, N. R.; Holt, J. G. (1984-1989) Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Bd. 1-4, Williams
& Wilkins, Baltimore

Einführung in die Biotechnologie - 8 - Scheper, TCI Hannover
- Bakterien mit Anhängseln
- obligat parasitische Bakterien
- Mycoplasma-Gruppe (Bakterien ohne Zellwand)
- phototrophe Bakterien (Bakterien, die Photosynthese betreiben),
z. B. Cyanobakterien (Blaualgen)
Die nach dem dänischen Mikrobiologen Gram (1884)
benannte Färbung stellt ein wichtiges Kriterium bei der
Bestimmung von Bakterien dar, die sich in GRAMpositive
und GRAM-negative Keime klassifizieren lassen
(s. Abb. 3.5). Später wurde herausgefunden, daß diese
Anfärbung in der Hauptsache mit der Dicke der
Zellwand korreliert. Diese besteht bei den Bacteria aus
einem Peptidoglycan, dem sogenannten Murein. Zwei
unterschiedliche Monosaccharide, die sich beide auf
Glucose als Grundkörper zurückführen lassen, bilden
über glykosidische Bindungen lange Ketten, die über
Peptidbrücken miteinander zu einem Makromolekül
quervernetzt sind. Das Mureinnetz, auch als
Mureinsacculus bezeichnet, gleicht der Lederhülle eines
Balls, durch den Turgordruck des inneren, membranumschlossenen
Teils wird die Stabilität
gewährleistet. GRAM-positive und GRAM-negative
Bakterien unterscheiden sich in der Dicke der Zellwand.
Daneben besitzen GRAM-negative Keime noch eine sogenannte
äußere Membran (s. auch Abb. 3.3). Die
1. Lackbildung
Anfärbung mit Kristallviolett
und Behandlung mit
Jodlösung
2. Differenzierung
Entfärbung durch Alkohol
oder Aceton
3. Gegenfärbung
Behandlung der Zellen
mit einem Kontrastfarbstoff
z.B. Fuchsin
chemische Zusammensetzung der unterschiedlichen Zellwände kann deshalb erheblich
differieren. Die Art der vorkommenden Moleküle oder deren chemische Bindung dient daher
häufig auch als Merkmal bei der Bestimmung eines Bakteriums.
Im Prinzip verläuft die GRAM-Färbung über die Herstellung eines wasserunlöslichen blauen
„Lackes“ in allen Zellen. Mit einem Lösemittel werden die Bakterien differenziert, d. h.
GRAM-negative werden dabei entfärbt, während GRAM-positive blau bleiben. Die farblosen
Zellen können dann noch mit einem anderen Farbstoff gegengefärbt werden.
Die Zellwand bzw. äußere Membran kann wieder von einer Kapsel umgeben sein (s.
Tuschekontrastierung, 1. Mikrobiol. Versuch, s. Kap. 1). Dabei handelt es sich um
Polysaccharid- oder Polypeptidschichten, die auf den Bakterien haften. Wenn sich diese
Schichten ablösen, entstehen Schleime. In biotechnologischen Prozessen ist die Produktion
von Kapseln oder Schleimen meist unerwünscht. Zum einen wird der Stoffaustausch
zwischen den Zellen und dem sie umgebenden Medium eingeschränkt und die Viskosität der
Nährlösung unnötig erhöht. Des weiteren können die Bakterien bzw. deren Schleime an
ungünstigen Stellen haften bleiben und Ventile, Pumpen u. a. verstopfen. Außerdem ist die
Kapsel- bzw. Schleimproduktion ein Syntheseweg, der in der Regel zu nutzlosen
Nebenprodukten führt und damit auf Kosten der Produktausbeute geht. Unter natürlichen
Bedingungen verleihen sie ihrem Träger Haftung und Schutz. In bestimmten Fällen können
sich Prokaryonten, z. T. unter Schleimabsonderung, auf festen Oberflächen fortbewegen. Sie
hinterlassen dann Schleimspuren, die, wenngleich auch sehr viel kleiner, vergleichbar denen
von Schnecken sind. Weitaus die meisten beweglichen Bakterien verfügen über Geißeln, die
durch Rotation die Zelle vorantreiben können.
Nur wenige Bakteriengruppen sind in der Lage, Dauerformen auszubilden. Am meisten
verbreitet sind dabei die sogenannten Endosporen, die gegen Strahlung, Trockenheit, hohe
blau
blau
blau
blau
rot
Abb.3.5: Die Durchführung
der Gram-Färbung
(links: GRAM-positiv
rechts: GRAM-negativ)

Einführung in die Biotechnologie - 9 - Scheper, TCI Hannover
Temperaturen und Chemikalien am widerstandsfähigsten sind. Die oft im Vergleich zur
Ausgangszelle nur ca. 1 /10 so große Spore wird intrazellulär gebildet und anschließend
freigesetzt. Die reifen Sporen zeigen keine erkennbare Stoffwechselaktivität; sie können so
bis zu 1.000 Jahre überleben und bei Verbesserung der Außenbedingungen wieder auskeimen.
Das Autoklavieren (20 min, 121°C) zielt auf die Abtötung der Sporen ab, denn vegetative
Zellen können meist bereits durch einfachere Verfahren (z. B. 10 min Erhitzung auf 60°C)
eliminiert werden.
In der Tabelle 2 sind einige biotechnologische Anwendungen von Bakterien aufgelistet, die
einen groben Überblick über die Vielfalt vermitteln soll.
Tab. 2: Einsatz von Bakterien in der Biotechnologie
Industrie- Anwendung/Produkt Beispiele
zweig
Nahrung Milch Joghurt, Buttermilch, Kefir, verschiedene
Soja
Sauerkraut
Essig
Aromastoffe
Polysaccharide
Käsesorten
Tempeh (zusammen mit Pilzen)
Natto (sauermilchartiges Getränk)
Alginat (für Speiseeis)
Xanthan (in Getränken, Verdickungsmittel)
Pectinolytischen Enyzme zur Fruchtsaftklärung
Amylasen
in der Getränkeindustrie zur Stärkeverflüssigung
Chemie
Aceton
Butanol
Milchsäure
Aminosäuren L-Lysin, L-Glutaminsäure, L-Arginin u. a.
Pharma Antibiotika Streptomycin, Tetracyclin, Penicillin
Insulin
(gentechnisch)
Interferon
(gentechnisch) wird ebenfalls durch Zellkultivierung
gewonnen
Vitamine Vit. B 12
Steroide
(s. Kap. 1.3.1) (neben Pilzen)
Landwirtschaft Bioinsektizide von Bacillus thuringiensis
Futtermittelkonservierung Silage
Umweltbiotechnologie
Gewinnung hochwertiger = Leaching
Metalle aus Erzen
Entschwefelung von Kohle = Leaching (Schadstoffreduzierung bei der
Kohleverfeuerung)
Kompostierung
neben Pilzen
Reinigung von Abwässern Klärwerk, neben Pilzen
Abluftreinigung
neben Pilzen
Altlastensanierung neben Pilzen
Gentechnologie Standardorganismus E. coli (s. Kap. XX (Gentechnikteil))
Sonstiges Enzyme in Waschmitteln Proteasen, Lipasen oder Cellulasen
Zusatzstoffe in der Kosmetikindustrie
Polysaccharide in Cremes
Biogasproduktion zur Energiegewinnung
Methangärung
In den folgenden Kapiteln werden verschiedene in der Tabelle aufgelistete Aspekte
ausführlicher dargelegt, daher sollen sie hier nicht näher behandelt werden.

Einführung in die Biotechnologie - 10 - Scheper, TCI Hannover
Archaea
In Faultürmen von Kläranlagen, in Salzseen und Salinen, auf glimmenden Kohleabraumhalden,
in kochenden Wasserquellen: Die Vertreter dieser Gruppe finden sich fast
ausnahmslos an extremen Standorten. Im Englischen heißen sie daher bezeichnenderweise
auch „Extremophiles“ (extrem (lat.) äußerst, radikal / phil- (griech.) Freund). In der
Hauptsache lassen sich die Archaea drei verschiedenen Untergruppen zuordnen:
- Methanogene Bakterien
(Methanbildung durch anaeroben Abbau von organischer Substanz)
- Halobakterien
(optimales Wachstum in einer 3,5 bis 4,5 M NaCl-Lösung, zum Vergleich: Meerwasser:
0,6 M)
- thermo-acidophile Bakterien
(heterogene Gruppe, Wachstumsoptima bei hohen Temperaturen (teilweise über 100°C)
und niedrigen pH-Werten (pH 1-2))
Daneben gibt es aber auch noch Vertreter, die ihr Wachstumsoptimum bei niedrigen
Temperaturen (5-20°C) oder bei pH-Werten > 9 haben. Die folgende Tabelle gibt einige
wichtige unterschiedliche Merkmale zwischen Archaea und Bacteria wieder:
Tab. 3: Gegenüberstellung der wichtigsten Unterschiede zwischen Archaea und Bacteria
Archaea
Pseudomurein oder völlig andere Materialien
in der Zellwand
viele Besonderheiten bezüglich der Membran,
z. B. Glycerindiether bzw. Diglycerintetraether
mit C 20 oder C 40 -Isoprenoideinheiten als Kohlenwasserstoffrest:
Bacteria
Zellwand aus Murein
in der Cytoplasmamembran: Glycerinester:
langkettige Fettsäuren sind mit Glycerin über
Esterbindungen verbunden
HO
O
O
HO
O
O O O
Penicillin, Chloramphenicol u. a. Antibiotika
zeigen keine Wirkung
viele stoffwechselphysiologische Eigenarten:
spezielle Stoffwechselwege, neue oder andere
Enzyme und Coenzyme, Unterschiede bei der
Protein- oder Nucleinsäurebiosynthese
mehr oder weniger gute Wirkung der Antibiotika
In der Biotechnologie finden Archaea oder deren Produkte zunehmend Anwendung, doch die
Palette der Nutzungsmöglichkeiten ist noch längst nicht ausgeschöpft.
Zur Zeit werden in erster Linie thermostabile Enzyme bei industriellen oder anderen
Prozessen eingesetzt, beispielsweise beim Abbau von Polymeren zu weiterverwertbaren
Monomeren. Etablierte industrielle Prozesse, wie z. B. die Verzuckerung von Stärke, können
durch Proteine von Archaea vereinfacht und damit effizienter gemacht werden. Im Rahmen
der Biosensorik werden biologische Komponenten mit Transducern gekoppelt, um die
sensitive und reproduzierbare Messung von Analytmolekülen zu ermöglichen. Vielfach sind
die Anwendungsmöglichkeiten dabei aber beschränkt, da die angewendeten Enzyme nicht
stabil genug sind. Durch den Einsatz von Proteinen aus Archaea kann dieser Nachteil umgangen
werden.

Einführung in die Biotechnologie - 11 - Scheper, TCI Hannover
Ebenso können aber auch ganze Zellen zur Anwendung kommen. So werden z. B. Federn,
die in großen Mengen bei der Geflügelhaltung anfallen, durch Kultivierung mit einem
Vertreter der Archaea bei vergleichsweise hohen Temperaturen (50-110°C) abgebaut. Vorteil
dabei ist nicht nur, daß das Entsorgungsproblem gelöst wird, sondern auch, daß aus dem
Keratin, aus dem die Federn bestehen, auch noch die Aminosäuren gewonnen werden können.
Die Anwendungsmöglichkeiten beschränken sich aber nicht nur auf die Nutzung der
thermostabilen Enzyme; auch andere Bestandteile wie z. B. Membrankomponenten oder
Speicherstoffe der Archaea könnten in biotechnologischen Prozessen Anwendungen finden.
Viele Arbeitsgruppen beschäftigen sich derzeit mit der Isolierung, der Charakterisierung und
dem biotechnologischen Einsatz dieser sehr interessanten Mikroorganismenguppe.
3.4. Die verschiedenen Gruppen der Eukaryonten
Pilze
Der Champignon ist wohl der bekannteste
Vertreter dieser Gruppe, die insgesamt weit
mehr als 100.000 Arten umfaßt. Meist
führen die Pilze ein Leben im
Verborgenen; nur wenn sie Fruchtkörper
bilden, fallen sie auf. Der prächtige Hut ist
nur ein sehr kleiner Teil des eigentlichen
Pilzes: Viele bilden Zellfäden, die als
Hyphen bezeichnet werden. Die
Gesamtheit der Hyphen bildet das Myzel.
Der Hauptteil des Myzels des
Champignons befindet sich beispielsweise
im Boden, zur Bildung des Fruchtkörpers
wachsen die Hyphen in einem
„Pseudogewebe“; in der großen Masse
werden sie dann für das bloße Auge
sichtbar (s. Abb. 3.6). Aufgrund ihrer
normalerweise mikroskopisch kleinen
Ausmaße fallen die Pilze ins Fachgebiet
der Mikrobiologie (s. Kap. 1).
Im Unterschied zu den bisher
behandelten Organismengruppen, den
Bacteria und den Archaea, verfügen die
Pilze über echte Kernmembranen und auch
alle anderen Merkmale, durch die sich
Eukaryonten auszeichnen (s. Tab. 1).
Im Gegensatz zu den Pflanzen können
sie jedoch das Sonnenlicht nicht zur
Energiegewinnung nutzen; sie sind also auf
Abb. 3.6: Fruchtkörper eines Hutpilzes
(Basidio-mycet)
links: Hyphengeflecht (Myzel) (schematisch)
rechts: makroskopisch häufig erkennbare
überirdische Teile
die Zufuhr organischer Verbindungen angewiesen. Pilze leben daher entweder:
- symbiontisch,
- parasitisch oder
- saprobisch
Flechten sind beispielsweise Assoziationen von Pilzen und Algen. In der Gemeinschaft
können sie als Pioniere Lebensräume besiedeln, in denen andere Organismen, aber auch die
Symbiosepartner einzeln nicht überleben könnten. Wegen des exponierten Vorkommens der

Einführung in die Biotechnologie - 12 - Scheper, TCI Hannover
Flechten und ihrer Empfindlichkeit gegenüber Luftverunreinigungen läßt eine systematische
Kartierung Rückschlüsse auf die Luftqualität im Untersuchungsgebiet zu. Als Mykorrhiza
(„Pilzwurzel“) wird die Symbiose zwischen Pilzen und vielen höheren Pflanzen bezeichnet,
die über die Wurzeln miteinander in Kontakt stehen.
Neben diesem Zusammenleben artverschiedener Organismen zum gegenseitigen Nutzen ist
der Parasitismus (Schmarotzertum) bei Pilzen ebenfalls verbeitet: Hierbei profitiert nur ein
Partner auf Kosten des anderen. Die Schäden, die jährlich durch Pilze weltweit an
Kulturpflanzen verursacht werden, sind beträchtlich. Demgegenüber ist nur ein sehr geringer
Anteil dieser Eukaryonten humanpathogen; die sogenannten „Fußpilze“ stellen wohl die
bekannteste und auch verbreitetste Gruppe dar.
Saprobisch lebende Pilze wachsen auf toten organischem Material, sind also beispielsweise
auf Komposthaufen, abgesägten Bäumen, eingelagerten Nahrungsmitteln oder verendeten
Tieren zu finden. Die Pilze stellen einen großen Teil der Destruenten und spielen daher eine
wichtige Rolle im Kreislauf der Natur (s. Kap. 1). Diese Mikroorganismen sind aber aufgrund
ihrer ausgeprägten Fähigkeit zum Polymerabbau durchaus in der Lage, Kleidungsstücke oder
verbautes Holz u. ä. zu zerstören. So stellt beispielsweise der Befall eines Wohnhauses mit
dem sogenannten Hausschwamm (Serpula lacrymans = Merulius l.) auch heute noch ein ernst
zu nehmendes Problem dar.
Von den Tieren unterscheidet die Pilze, daß in mindestens einer Phase ihres Lebenszyklus
Zellwände ausgebildet werden. Wie der „Panzer“ bei Insekten ist der Hauptbestandteil dieser
Zellwände vielfach Chitin.
Wie bei den Prokaryonten kann auch hier nur eine sehr einfache Einteilung der Pilze
wiedergegeben werden, da eine ausführlichere Behandlung den Rahmen dieser Einführung
sprengen würde. Als weitergehende Literatur der Mykologie (Pilz: (griech.) mykos, (lat.)
fungus) wird auf das Buch „MYKOLOGIE“ von E. Müller und W. Löffler 4 , sowie auf
„KRYPTOGAMEN“ von K. Esser 5 verwiesen. Einige biotechnologisch interessante Vertreter
werden jeweils bei den entsprechenden Gruppen aufgeführt.
1. echte Schleimpilze (Myxomyceten)
zelluläre Schleimpilze (Acrasiomyceten)
2. niedere Pilze (Phycomyceten)
3. höhere Pilze (Eumyceten)
a. Schlauchpilze (Ascomyceten)
Saccharomyces (Bier- oder Bäckerhefe), Claviceps (Mutterkornpilz),
Neurospora, Morchella (Morchel), Tuber (Trüffel)
b. Ständerpilze (Basidiomyceten)
Agaricus (Champignon), Serpula (Hausschwamm)
c. Fungi imperfecti (Deuteromyceten)
Aspergillus (Gießkannenschimmel), Penicillium (Pinselschimmel)
Neben einer großen Reihe von durch Pilze verursachte Schadwirkungen stehen aber auch sehr
viele Nutzanwendungen:
- Nahrungsmittel
4 Müller, E.; Loeffler, W. (1982) Mykologie: Grundriß für Naturwissenschaftler und Mediziner.
4., überarb. u. erw. Aufl., Thieme, Stuttgart • New York
5 Esser, K. (1986) Kryptogamen: Cyanobakterien, Algen, Pilze, Flechten. 2. Aufl., Springer,
Berlin • Heidelberg • New York • Tokyo

Einführung in die Biotechnologie - 13 - Scheper, TCI Hannover
- Produktgewinnung durch Kultivierung
- Biotransformationen
- Beseitigung von Abfall- oder Schadstoffen
Im folgenden soll auf die verschiedenen Stichpunkte eingegangen werden. Neben diesen
biotechnologischen Aspekten sollen aber auch weitere mykologische Grundlagen beschrieben
werden.
Seit langem werden Pilze gesammelt oder sogar speziell kultiviert, um sie als
Nahrungsmittel zu nutzen. Dabei sind genaue Kenntnisse vonnöten, um die ungiftigen von
giftigen Vertretern unterscheiden zu können. Des weiteren macht man sich die Bildung von
Aromastoffen z. B. bei der Veredelung von Nahrungsmitteln zunutze. So sind
Penicilliumarten für den intensiven und markanten Geschmack vieler Schimmelkäse
(Camembert, Roquefort, Brie) verantwortlich. Vertreter der gleichen Gruppe sorgen für den
weißen Schimmelüberzug auf
Salami. Die Hefen
(Sproßpilze) sind die
biotechnologisch wohl interessanteste
Gruppe (Abb. 3.7).
Nicht nur bei der Bier-,
Wein- und Brotherstellung,
sondern auch bei vielen
anderen industriellen Prozessen
wird diese Pilzgruppe
eingesetzt. Neben Ethanol
werden dabei u. a. auch
Glycerin, Fette und
Mutterzelle
sprossende Tochterzelle
Sproßnarbe
1 2 3
4 5 6
Abb. 3.7: Zellsprossung am Beispiel der Hefe Saccharomyces cerevisiae
(schematisch, sechs aufeinanderfolgende Stadien gezeigt)
(Zellmaße der Mutterzelle: ca. 5 * 8 µm)
Fettsäuren durch Hefekultivierung wirtschaftlich produziert. Saccharomyces cerevisiae ist
der bestuntersuchte Eukaryont und spielt auch eine wichtige Rolle in der Gentechnik (s. Kap.
XX, (Gentechnikteil)). S. cerevisiae, die aufgrund ihrer vielfältigen Einsatzmöglichkeiten
auch allgemein als Bier- oder Bäckerhefe bezeichnet wird, hat einen relativ einfachen
Lebenszyklus.

Einführung in die Biotechnologie - 14 - Scheper, TCI Hannover
In der Mykologie ist die Darstellung von Lebenszyklen gebräuchlich, um alle
morphologischen und physiologischen Formen eines Pilzes zu erfassen und deren Beziehung
deutlich zu machen. Anders als beispielsweise beim Menschen, bei dem sich aus diploiden
vegetativen Zellen durch Meiose haploide Keimzellen bilden, die sich nach Vereinigung
wieder zu diploiden vegetativen Zellen entwickeln, sind die Verhältnisse bei Pilzen sehr viel
vielfältiger und komplexer (s. Kap. 1.4.4). Einerseits gibt es neben der sexuellen Vermehrung,
die immer eine
Neukombination
von Erbmaterial
Kernverschmelzung
(Karyogamie)
Vermehrung durch
Sprossung
Zygote
Spore
Vereinigung zweier
Ascosporen
(Plasmogamie)
aus Ascospore
gekeimte
haploide Zelle
Ascus, (Ort
der Meiose
und Ascosporendifferenzierung)
Ascospore
(haploid)
Vermehrung durch
Sprossung
vegetative,
diploide Zellen
vegetative,
haploide Zellen
weitere
Vermehrung durch
Sprossung
Ascusbildung
weitere
Vermehrung
durch
Sprossung
mit einschließt,
auch eine
vegetative asexuelle
Vermehrung,
wie sie z. B. auch
bei Pflanzen auftritt.
Auf die
Plasmogamie, also
die Verschmelzung
irgendwie gearteter
Vermehrungsstrukturen,
folgt
nicht unmittelbar
zwingend die
Karyogamie, d. h.
die Vereinigung der
Zellkerne. Es gibt
bei den Pilzen
deshalb nicht nur
haploide oder
diploide Zellen,
sondern ebenfalls
Formen mit zwei
oder mehr
Zellkernen.
Letzteres tritt zwar
nicht bei S.
cerevisiae auf
Abb. 3.8: 3.9: Entwicklungszyklus Sporenträger von Penicillium
Bildung roqueforti von Asci nur bei Anzucht auf „armen“ Medien
können an diesem
von Saccharomyces cerevisiae
(Abb. 3.8), doch
-
- Die viele Abbildung Kulturrassen macht bilden die überhaupt keine Asci mehr
Beispiel einige
- die Haploide Bezeichnung Vermehrung „Pinselschimmel“
erreichbar (s. Esser) für die
nicht natürlich, sondern nur künstlich
andere
Gruppe allgemein deutlich.
(Ausschnitt)
illustriert werden.
Sachverhalte
Zur näheren
Beschäftigung mit
dem Thema Pilze
sei auf o. g. Lehrbücher verwiesen. Des weiteren wird im 2. Kapitel eine Kultivierung mit
dieser Hefe durchgeführt.
.

Einführung in die Biotechnologie - 15 - Scheper, TCI Hannover
Das Vorhandensein von vegetativen und sexuellen Vermehrungsformen kann für
unterschiedliche Zwecke ausgenutzt werden: zur Herstellung von Biomasse wird die
asexuelle Vermehrung, zum Gewinn von Organismen mit neuartigen oder kombinierten
Eigenschaften die sexuelle Vermehrung forciert. Die Kultivierung myzelbildender Pilze wie
beispielsweise Aspergillus- und Penicilliumarten führt zu Problemen bei der technischen
Handhabung (s. Abb. 3.9). Da meist nur ein endständiges Wachstum stattfindet, ist von der
gesamten Myzelmasse nur ein geringer Teil stoffwechselaktiv. Das im Vergleich mit
Bakterien oder zellulären Pilzen dichte Wachstum birgt bei der Nährstoffversorgung Probleme,
die zusätzlich durch die meist eintretende Viskositätserhöhung des Mediums noch
verstärkt werden. Für die Sporenbildung wird häufig zusätzlich ein Teil der
Stoffwechselenergie durch den Pilz verbraucht, die dann nicht mehr für die Produktsynthese
zur Verfügung steht. Aus diesen Gründen werden oft nur vergleichsweise geringe Raum-Zeit-
Ausbeuten erreicht. Im Gegensatz zu den zellulären Pilzen, wo ein Kern pro Zelle vorliegt, ist
des weiteren der Einsatz gentechnischer Methoden bei Hyphenpilzen erschwert. Die
Zellkerne können keinen distinkten Bereichen im Zellschlauch zugeordnet werden, sondern
sind mehr oder weniger beweglich. Trotz dieser Nachteile sind es vor allem Schimmelpilze,
die neben den Hefen eine breite Anwendung in der Biotechnologie gefunden haben.
Neben Ethanol, „CO 2 “, Fetten und Fettsäuren gibt es noch viele weitere industriell relevante
Produkte, die durch Kultivierung von Pilzen gewonnen werden können:
- Organische Säuren
Herstellung von Citronensäure, Gluconsäure oder Oxalsäure beispielsweise durch Schimmelpilze
(so wird die Citronensäure durch Aspergillus niger produziert, wenn Anfangs-pH-
Werte von 2,5 - 3,5 und Manganmangelbedin-gungen
herrschen).
HO
CH 2
C
CH 2
COOH
COOH
COOH
Abb. 3.10:
Citronensäure

Einführung in die Biotechnologie - 16 - Scheper, TCI Hannover
- Mono- bzw. Polysaccharide
z. B. das D-Mannit oder das als Nahrungsmittelzusatz oder Foliengrundstoff gebräuchliche
Pullulan
- Vitamine
z. B. das Riboflavin (Vit. B 2 )
- Enzyme
Auswahl: Pectinasen, Glucamylasen und ß-Galactosidasen, Cellulasen, Labferment
- Antibiotika
Penicillin (Abb. 3.11), Cephalosporin u. a.
Ersteres wird durch verschiedene Penicilliumarten
gebildet. Das Antibiotikum wirkt hauptsächlich
auf GRAM-positive Bakterien. Es beeinträchtigt
die Quervernetzung des Mureinsacculus
über Peptidbrücken bei wachsenden Zellen
(s. Kap. 1.2.1).
- Alkaloide
Diese werden durch Claviceps spec. gebildet und finden wie die Antibiotika Anwendung in
der Medizin.
Ein weiteres Gebiet, in dem Pilze in der Biotechnologie Anwendung finden, sind die
sogenannten Biotransformationen. Dabei wird ausgenutzt, daß Mikroorganismen sehr selektiv
chemische Reaktionen an hauptsächlich makromolekularen Stoffen durchführen können.
Durch Biotransformationen konnten viele vormals
O
HO
O
Progesteron
11-α-Hydroxyprogesteron
Abb. 3.12: Die mikrobielle
Hydroxylierung von
Progesteron führt zum 11-α-
Hydroxyprogesteron
R
CO
NH
O
chemische nur sehr aufwendig durchführbare
Synthesen vereinfacht und wirtschaftlicher gemacht
werden. Dies gilt vor allem für die Herstellung von
Steroiden, die in der Medizin beispielsweise als
entzündungshemmende Medikamente oder als
Wirkstoff in Antibabypillen Anwendung finden. Die
Abb. 3.12 stellt eine mikrobiell katalysierte
Einzelschrittreaktion dar, die u. a. für die Synthese
von Cortison wichtig ist. Daneben können durch
Biotransformationen auch mehrere Reaktionen, also
Teilsynthesen, katalysiert werden. Reaktions- und
Stereoselektivität, Regiospezifität und milde
Reaktionsbedingungen sind die Vorteile, die sich
bei diesem biologischen Verfahren gegenüber
chemischen Prozessen ergeben.
N
Abb. 3.11 Penicillin
S
COOH

Einführung in die Biotechnologie - 17 - Scheper, TCI Hannover
Pilze sind ebenfalls an der Kompostierung beteiligt. Ein großer Anteil des Hausmülls aber
auch anderer Abfälle aus u. a. Agrar- bzw. Forstwirtschaft besteht aus Cellulose,
Hemicellulosen und Lignin. Am Abbau dieser Substanzen sind maßgeblich Pilze beteiligt, da
sie durch die Ausscheidung von Exoenzymen
diese wasserunlöslichen Substanzen zerkleinern,
anschließend aufnehmen und dann
metabolisieren können. Je nachdem, welcher
Anteil des Holzes durch den Pilz verwertet
werden kann, werden Braun- und Weißfäulepilze
unterschieden. Pilze, die die weiße Cellulose
zurücklassen, heißen Weißfäulepilze,
demgegenüber werden als Braunfäulepilze
diejenigen bezeichnet, die das braune Lignin
nicht, nur wenig oder erst später angreifen (wie z.
B. Serpula) So können z. B. auch vorhandene Schadstoffe angegriffen werden. Schon recht
früh wurde nachgewiesen, daß der Weißfäule verursachende Pilz Phanerochaete
chrysosporium schwerabbaubare Schadstoffe wie Benzo(a)pyren (Abb. 3.13) oder andere
Substanzen modifizieren kann.
Algen und Protozoen
Sowohl die Algen als auch die Protozoen fallen in Grenzbereiche zu verschiedenen anderen
biologischen Teilgebieten (s. Kap. 1). Der Vollständigkeit halber sollen sie hier kurz
behandelt werden.
Die Algen stellen eine sehr heterogene
Gruppe niederer pflanzlicher Organismen dar,
die sich durch den Besitz von Chlorophyll
auszeichnen. Die darauf zurückzuführende
Grünfärbung kann durch braune, rote oder
blaue Farbstoffe überdeckt sein. Die Algen
betreiben in der überwiegenden Mehrzahl
Photosynthese und gewinnen ihren
Zellkohlenstoff durch Fixierung von
Kohlendioxid aus der Luft: Ihre Lebensweise
wird daher als photoautotroph bezeichnet. Sie
gehören deshalb schwerpunktmäßig in das
Gebiet der Botanik. Die einzelligen bis
vielzelligen Vertreter fallen im Alltagsleben
meist durch ihr Wachstum in Aquarien,
Wasserkühlkreisläufen, Gießkannen und ähnlichen
nassen und hellen Biotopen auf, wo sie
neben Cyanobakterien und anderen
photosynthetisch aktiven Prokaryonten
optimale Lebensbedingungen finden. Als
repräsentativer Organismus wurde
Chlamydomonas spec. ausgesucht, der im
Süßwasser weit verbreitet ist (s. Abb. 3.14)
Abb. 3.13: Strukturformel
des
Benzo(a)pyrens
Von der biotechnologischen Bedeutung her treten die Algen hinter die anderen
Mikroorganismen zurück. Sie werden einerseits zur Rohstoffproduktion eingesetzt: Agar, der
als ausgezeichnetes Verfestigungsmittel in der Mikrobiologie breite Anwendung gefunden
hat, wird beispielsweise aus Rotalgen gewonnen. Seit langem werden Algen andererseits v. a.
in asiatischen Ländern als Nahrungsquelle genutzt. Die photosynthetisch aktiven Organismen
Geißel
pulsierende
Vakuolen
Augenfleck
(= Stigma)
becherförmiger
Chloroplast
Nucleus
(Zellkern)
Pyrenoid
(verdichteter Bereich
im Chloroplasten)
Plasmalemma
Zellwand
Abb. 3.14: Die Grünalge Chlamydomonas
spec.
(schematisch) Zellmaße: ca. 14 * 8 µm

Einführung in die Biotechnologie - 18 - Scheper, TCI Hannover
können sich ebenfalls an dem Licht ausgesetzten Orten von Klärwerken ansiedeln und dort an
der Abwasserreinigung beteiligt sein.
Auch die Protozoen stellen eine sehr heterogene Gruppe dar. Im Prinzip können sie als
„einfache Tierchen“ bezeichnet werden, da sie sich in der Regel chemoheterotroph ernähren
(s. Kap. 1.4.2). Das bedeutet, daß sie Energie durch Atmung gewinnen und organische
Verbindungen zum Aufbau zelleigener Substanz verwerten. Sie sind also auf die Zufuhr von
Nahrungsstoffen angewiesen (= Konsumenten, s. Kap. 1). In der Hauptsache sind die
Protozoen Einzeller, es kommen jedoch auch einige Mehrzeller bzw. Übergangsformen zu
Pilzen und Algen vor. Sie leben bevorzugt im humiden Erdreich, Wasser oder vergleichbaren
feuchten - nassen Biotopen. Aber auch an oder in Tieren wie beispielsweise im Pansen von
Wiederkäuern werden sie in großer Zahl gefunden. Dabei verwundert es nicht, daß es viele
pathogene Vertreter gibt, die z. T. auch ernsthafte Krankheiten beim Menschen verursachen
können. So werden z. B. Malaria oder die Schlafkrankheit zu den sogenannten Protozoonosen
gezählt. Die Amöben gehören wohl mit zu den bekanntesten Protozoen; sie haben keine feste
Körperform, was ihnen den deutschen Namen Wechseltierchen eingetragen hat. Ihre
Nahrung, die aus Algen, Bakterien u. a. organischem Material besteht, nehmen sie auf, indem
sie die Partikel umfließen (s. Abb. 3.15).
Wie die Algen spielen die Protozoen auch eine gewisse Rolle bei der Abwasserbehandlung.
Die „Tierchen“ werden auch in Biotests eingesetzt, um beispielsweise die Toxizität giftiger
Chemikalien oder die Qualität von Abwasser zu erfassen.
Nucleus (Zellkern)
Angedeuteter Übergang
zwischen Endo- und
Ektoplasma (inneres
und äußeres Cytoplasma)
Nahrungsvakuole
kontraktile Vakuole
Bewegungsrichtung
Abb. 3.15: Amoeba proteus
(schematisch)

Einführung in die Biotechnologie - 19 - Scheper, TCI Hannover
Tierische und pflanzliche Zellkulturen
Viele der in der Zellkultivierung gebäuchlichen Techniken stammen aus der Mikrobiologie,
nicht zuletzt deshalb, weil auch die Zellen über mikroskopisch kleine Ausmaße verfügen.
Daher wird dieses Thema ebenfalls in diesem Abschnitt behandelt.
In der Biotechnologie spielen vor allem tierische Zellkulturen eine immer größere Rolle. Sie
werden primär eingesetzt, um Human-Proteine zu gewinnen, die nach ihrer Synthese noch in
einer für Eukaryonten spezifischen Weise modifiziert werden müssen, etwa durch Anhängung
von Zuckerresten. Prokaryonten sind hierzu meist nicht in der Lage. Des weiteren können
Impfstoffe oder Antikörper durch tierische Zellkultivierung gewonnen werden. Zum Teil
werden bereits transgene Tiere als „lebende Bioreaktoren“ eingesetzt.
Im Prinzip können tierische Zellen auf zweierlei Art außerhalb des Organismus kultiviert
werden:
1. als Explantat in Form einer Organ- bzw. Gewebekultur, wobei Aufbau und Funktion des
Explantats erhalten bleiben, sowie
2. als Zellkultur. Diese wird gewonnen, indem das Gewebe durch mechanische oder
chemische Mittel zerstört wird. Aus den so gewonnenen Zellen kann unter geeigneten
Bedingungen eine Primärkultur wachsen, die durch anschließende Subkultivierung zu
einer sekundären Zellinie führt. Wenn dieses Überimpfen (Passagieren) unendlich
weitergeführt werden kann, ohne daß die Zellen absterben, liegt eine Dauerzellinie
(„etablierte“ oder „stabile“ Zellinie) vor. Bekannte Beispiele sind:
HeLa-Zellen: Gebärmutterkrebszellen, ursprünglich 1951 von Henrietta Lacks entnommen
BHK-Zellen: baby hamster kidney-Zellen aus dem Nierengewebe neugeborener syrischer Hamster
CHO-Zellen: chinese hamster ovary-Zellen (Eierstock des chinesischen Hamsters)
MK-Zellen: monkey kidney-Zellen (Affenniere)
Tierische Zellkulturen sind nicht einfach zu handhaben. Zum einen müssen bei der
Kultivierung Verhältnisse geschaffen werden, die denen im Ursprungsorganismus möglichst
genau entsprechen. Dies erfordert neben aufwendiger Apparatur auch spezielle Medien. Zum
anderen sind die Tierzellkulturen extrem anfällig gegenüber Fremdkeimen (Kontaminanten),
was spezielle Sterilisations- und Sterilhaltungstechniken erfordert. Viele tierische Zellen, an
das Leben in Verbänden gewöhnt, benötigen eine feste Oberfläche zum Wachstum (sog.
adhärente Zellen), was jedoch zu Problemen mit dem Stoffaustausch führen kann. Des
weiteren sind die Zellen, ob frei oder adhärent, extrem scherstreßempfindlich, da sie nur über
ihre Plasmamembran von der Außenwelt getrennt sind. Sie könnten sogar durch eine
aufsteigende Luftblase zerrissen werden, so daß neue, feinere Begasungssysteme entwickelt
werden mußten.
Pflanzliche Zellkulturen finden biotechnologische Anwendung in der Grundlagenforschung
und bei der klonalen Massenvermehrung wichtiger Nutzpflanzen oder Züchtung neuer
Kulturpflanzen. Ebenso ist die Gewinnung von pflanzlichen Wirkstoffen, beispielsweise von
Aromastoffen, Opiaten oder Steroiden, durch Pflanzenzellkultur üblich. Vergleichbar der
tierischen Zellkultur lassen sich Explantate auf festen Medien zu Mitosen anregen (s. Kap.
1.4.4). Diese bilden dann aber einen sogenannten Kallus, das ist ein Gewebekomplex mit
entdifferenzierten Zellen. Demgegenüber lassen sich auch Zellen ohne Zellwand gewinnen
und zur Vermehrung bringen. In diesem Fall wird von einer Protoplastenkultur gesprochen.
3.5. Mikrobielles Wachstum
Welche Faktoren beeinflussen die Biomasseproduktion in einem Bioreaktor?
In vielen biotechnologischen Prozessen ist das mikrobielle Wachstum der Schlüsselparameter:
speziell in ein System eingebrachte Mikroorganismen sollen sich vermehren,
während Kontaminanten ferngehalten werden sollen. Die Systeme, in denen ganze
Mikroorganismen oder aber nur Enzyme Stoffe produzieren oder abbauen, werden als

Einführung in die Biotechnologie - 20 - Scheper, TCI Hannover
Bioreaktoren bezeichnet. Ein Bioreaktor ist demzufolge ein Gefäß, in dem unter Beachtung
des jeweiligen Zieles optimale Bedingungen für die Biokomponente hergestellt werden, sowie
das Eindringen unerwünschter Kontaminanten unterbunden wird. Eine Ausnahme bilden viele
in der Umweltbiotechnologie eingesetzte Bioreaktoren, wobei der Eintrag von
Fremdorganismen vielfach sogar erwünscht ist. Die angestrebten optimalen Bedingungen
umfassen sowohl physikalische als auch chemische Komponenten:
physikalische Komponenten:
- Je nach Herkunft der zu kultivierenden Organismen liegt das Wachtumsoptimum bei
unterschiedlichen Temperaturen. So sind z. B. Arten, die den menschlichen Organismus
besiedeln wie beispielsweise Escherichia coli auf 37°C optimiert, während marine
Mikroorganismen bei Temperaturen um 4°C am besten wachsen.
- Wasser als universelles biologisches Lösungsmittel und Reaktionssubstrat spielt eine
eminent wichtige Rolle bei allen Lebensvorgängen. Das verfügbare Wasser wird durch die
Wasseraktivität A w bestimmt, die der relativen Feuchtigkeit äquivalent ist und definiert ist
als:
A
W
=
P
P
S
W
P s = Dampfdruck des Wassers über dem Wachstumssubstrat
P w = Dampfdruck des reines Wassers
Die meisten Bakterien wachsen nur bei A w -Werten nahe 1, während viele Pilze gegenüber
Trockenheit widerstandsfähiger (xerotoleranter) sind und bis hin zu A w -Werten um 0,6 noch
zu wachsen vermögen. Diesen Umstand macht man sich bei der Konservierung von
Lebensmitteln zunutze, indem diese einfach getrocknet (Haferflocken, Zwieback u. a.), oder
durch Zucker- oder Salzzusatz „trocken“ gemacht werden (beispielsweise Marmeladen,
Konfitüren).
- Der pH-Wert, definiert als der negative dekadische Logarithmus der H 3 O + -Ionenkonzentration,
ist ebenfalls eine wichtige Größe bei Kultivierungen von Mikroorganismen.
Die Pilze sind meist wesentlich säuretoleranter als die Bakterien; so wird z. B.
Saccharomyces cerevisiae bei pH-Werten um 5, Escherichia coli bei pH-Werten um 7
kultiviert.
- Je nach Mischungstechnik können unterschiedlich starke Scherkräfte auftreten, die sich u.
U. nachteilig auf das mikrobielle Wachstum auswirken können. So kann beispielsweise
Claviceps purpurea nur schlecht in gerührten Reaktoren kultiviert werden, da das Myzel
sehr scherstreßempfindlich ist.
chemische Komponenten:
- Ist die Gewinnung von Biomasse Ziel des biotechnologischen Kultivierungsprozesses, so
sollte das Medium alle Bestandteile in verwertbarer Form enthalten, die für das Wachstum
der Mikroorganismen notwendig sind. Aufgrund von Elementaranalysen lassen sich
folgende Elemente meist in recht hohen Konzentrationen in den Mikroorganismen
nachweisen: C, O, H, N, S, P, K, Ca, Mg, Fe. Sie werden daher als Makronährelemente
bezeichnet. Eisen wurde verschiedentlich auch schon in so geringen Mengen nachgewiesen,
daß es bei bestimmten Mikroorganismen auch den Charakter eines Mikronährelementes
(Spurenelementes) hat. Letztere werden häufig für Enzyme oder Coenzyme benötigt. Sie
kommen daher in der Regel nicht in allen, sondern nur in den diese Enzyme synthetisierenden
Organismen vor. So benötigen beispielsweise N 2 -fixierende Arten, also solche,
die den molekularen Stickstoff in organische Verbindungen überführen können, Molybdän

Einführung in die Biotechnologie - 21 - Scheper, TCI Hannover
als Spurenelement. Weitere Mikronährelemente sind u. a. Mn, Cu, Co, Se, Ni. Diese
Auflistung von Elementen sagt noch nichts darüber aus, in welcher chemischen Verbindung
diese vorliegen müssen, um verwertet werden zu können. Während die anderen Makro- und
Mikroelemente daher häufig in Form ihrer Salze dem Medium zugesetzt werden, muß der
Kohlenstoff in der Regel in Form einer organischen Verbindung zugesetzt werden, sofern es
sich um heterotrophe und nicht um autotrophe Organismen handelt (zu den Begriffen: s.
Kap. 1.4.2). Der zugesetzte Kohlenstoff dient in solchen Fällen häufig nicht allein als C-
Quelle für Zellbausteine wie Proteine, Nukleinsäuren oder Fettsäuren, sondern ebenso als
Energiequelle. Diese Aspekte werden im folgenden Kapitel noch ausführlicher behandelt.
Manche Mikroorganismen vermögen trotz einer verwertbaren C- und Energiequelle und
aller benötigten Mineralstoffe nicht auf dem Medium zu wachsen. Sie können nicht alle
Bausteine selbst synthetisieren, sondern sind darauf angewiesen, daß diese dem Medium
zugesetzt werden. Bei diesen als Suppline bezeichneten Stoffen handelt es sich
hauptsächlich um Aminosäuren (Proteinbausteine), Basen der Nukleinsäuren (Purine und
Pyrimidine) und Vitamine.
- Neben der Zusammensetzung des Mediums ist als weiterer chemischer Parameter die
Sauerstoffkonzentration wichtig. Aus dem Sauerstoff können sich leicht, z. B. durch
Lichteinfluß, noch reaktivere Sauerstoffspezies bilden, so daß die damit konfrontierten
Organismen über Entgiftungsmechanismen verfügen müssen. Mikroorganismen, die diese
nicht besitzen, werden als obligat anaerob bezeichnet. Sie können sich nur unter
Sauerstoffausschluß vermehren. Die Arbeit mit solchen Keimen erfordert einen höheren
apparativen Aufwand. Fakultative Anaerobier wachsen im Gegensatz dazu mit oder ohne
O 2 , einige können ihren Stoffwechsel entsprechend umstellen. Als letzte Gruppe stehen die
obligat aeroben Mikroorganismen: sie benötigen O 2 zum Wachstum.
Wachstumstypen
Um die Vielfalt der möglichen Wachstumstypen bei Mikroorganismen zu benennen, hat sich
eine bestimmte Terminologie eingebürgert, die in diesem Kapitel vorgestellt werden soll.
Prinzipiell werden dabei:
Kohlenstoffquelle
Energiequelle
Quelle der Reduktionsäquivalente
unterschieden.
Bereits erwähnt wurden die Fachbegriffe bezüglich der Herkunft des für die Zellbausteine
benötigen Kohlenstoffs. Autotrophe gewinnen diesen durch Fixierung von CO 2 , während
heterotrophe Organismen organische Verbindungen zum Aufbau zelleigener Substanzen
verwerten (s. Kap. 1.3.2).
Bezüglich der Energiegewinnung werden phototrophe, also Photosynthese betreibende
Organismen, und chemotrophe Organismen unterschieden. Letztere führen Redox-
Reaktionen durch, die sich vereinfachend als Atmung oder Gärung charakterisieren lassen.
Die Atmung ist ein Prozeß, bei dem Reduktionsäquivalente (Elektronen oder H) von einer
Ausgangsverbindung auf eine anorganische Zielverbindung unter Energiegewinn
übertragen werden (s. Kap. 1.4.3). Bei der Gärung werden jedoch die
Reduktionsäquivalente ebenfalls unter Energiegewinn von einer organischen
Ausgangsverbindung auf eine ebenfalls organische Zielverbindung übertragen. Gärung
findet in der Regel unter Ausschluß von O 2 statt, sie wird üblicherweise nach ihren
Hauptprodukten benannt, beispielsweise: Alkohol-, Milchsäure,- Propionsäure-,
Ameisensäure- und Buttersäuregärung.
Als letztes wird noch nach der Herkunft der Reduktionsäquivalente unterschieden. Von
Organotrophie wird gesprochen, wenn organische Verbindungen als Wasserstoffquelle

Einführung in die Biotechnologie - 22 - Scheper, TCI Hannover
eingesetzt werden, lithotrophe Organismen verwerten anorganische H-Donatoren wie z. B.
H 2 S, S, NH 3 , H 2 , Fe 2+ .
Pflanzen sind demnach photolithoautotroph, da sie erstens Photosynthese betreiben,
zweitens H 2 O als Quelle für Reduktionsäquivalente nutzen und drittens den Kohlenstoff
für Zellbausteine durch Fixierung von CO 2 gewinnen. Tiere demgegenüber sind
chemoorganoheterotroph, da sie Energie durch Atmung gewinnen und organische
Verbindungen als Wasserstoff- und Zellkohlenstoffquelle nutzen. Üblicherweise werden
nicht immer alle Bezeichnungen genannt. Im folgenden Kapitel werden weitere
grundlegende Aspekte des Stoffwechsels behandelt.
Mikrobieller Stoffwechsel
Was ist der „Stoffwechsel“? Damit werden sämtliche durch Organismen katalysierten
Reaktionen zusammengefaßt, wobei abbauende (katabole) und aufbauende (anabole)
Wege unterschieden werden. Stoffe müssen aus der Umwelt aufgenommen und verarbeitet
werden. Bausteine für beispielsweise die Synthese der Zellwand, DNA oder RNA,
Fettsäuren oder Proteine müssen gebildet (= synthetisiert) werden. Endprodukte müssen
entsorgt werden. Für viele Vorgänge muß Energie bereitgestellt werden, damit die
Reaktionen unter den recht milden Bedingungen in der Zelle überhaupt ablaufen können.
Der Organismus muß zusätzlich in der Lage sein, auf Änderungen des äußeren Milieus zu
reagieren, etwa bei Verschlechterung der Lebensbedingungen. Alle diese Wachstums- und
Lebensprozesse von Organismen gehen auf den Stoffwechsel zurück. Die
hochkoordinativen Prozesse gewährleisten, daß bestimmte Stoffe zu bestimmten Zeiten an
bestimmten Orten in bestimmter Weise zur Verfügung gestellt werden.
Die Werkzeuge des Stoffwechsels sind die Enzyme, die Informationen für den Bauplan
dieser Proteine sind auf der DNA festgelegt. Die Information muß zum richtigen Zeitpunkt
richtig abgelesen und übersetzt werden: eine weitere Leistung des Stoffwechsels.
(Genetische Aspekte werden in Kap. XX (Gentechnikteil) behandelt.)
Beim Vergleich des Stoffwechsels verschiedener Organismen fällt auf, daß sich
bestimmte „Motive“ häufig wiederholen. Die enzymatischen Reaktionen lassen sich auf
wenige Grundtypen zurückführen, bestimmte Stoffwechselwege sind in fast allen
Organismen vorhanden und auch der genetische Code, der den „Übersetzungsschlüssel“
von der DNA zum Protein darstellt, ist nahezu ubiquitär verbreitet.
Am Beispiel des sehr gut untersuchten Stoffwechsels von Saccharomyces cerevisiae
sollen einige weitere Grundlagen vermittelt werden (s. Abb. 3.16).

Einführung in die Biotechnologie - 23 - Scheper, TCI Hannover
anaerob
Gärung
H
HO
H
H
C OH
CH 3
Ethanol
CH 2 OH
O H
OH
H H
OH
H OH
Glucose
Glycolyse
H
- O O
C
C O
CH 3
CO2
Pyruvat
CO2
aerob
Atmung
TCC
H
CO2
CO2
Atmungskette
O 2
H
H 2 O
Energiegewinn an Mol ATP / Mol Glucose
2 38
Abb. 3.16: Stoffwechsel der Hefe Saccharomyces
cerevisiae unter anaeroben (links) und
aeroben (rechts) Bedingungen und
Energieausbeute
(TCC = Tricarbonsäurezyklus,
H = Reduktionsäquivalente)
Saccharide sind die in der Natur
am weitesten verbreiteten Moleküle.
So bestehen etwa Cellulose, Lignin,
Chitin oder Murein aus Glucosederivaten.
S. cerevisiae oxidiert Glucose,
wie übrigens auch wir Menschen, in
der sogenannten Glycolyse unter
Energiegewinn formal gesehen zu
zwei Molekülen Pyruvat. Die dabei
auftretenden Reduktionsäquivalente
(H oder Elektronen) werden dabei
auf spezielle Transportmoleküle
(NAD + und andere) übertragen, die
aber für die nächste Redoxreaktion
wieder regeneriert werden müssen.
Unter aeroben Bedingungen werden
die Reduktionsäquivalente in die
Atmungskette eingeschleust, wo sie
unter Energiegewinn letztendlich auf
den Sauerstoff in einer kontrollierten
Knallgasreaktion übertragen werden.
Unter anaeroben Bedingungen
steht aber kein Sauerstoff zur
Verfügung, folglich können die Reaktionen
der Atmungskette nicht
ablaufen. Die Reduktionsäquivalent-
Transportmoleküle müssen also auf
andere Art regeneriert werden. Die
Hefe verwendet dann einfach das
Endprodukt der Glycolyse, nämlich
Pyruvat. Dieses wird zur
Vorbereitung erst einmal
enzymatisch decarboxyliert, der
entstehende C 2 -Körper wird dann
unter Regeneration des
Reduktionsäquivalent-
Transportmoleküls zum Ethanol
reduziert. Dieser Stoffwechselweg ist die alkoholische Gärung, die beispielsweise bei der
Bier- und Weinproduktion durch S. cerevisiae ausgenutzt wird. Während das Pyruvat unter
anaeroben Bedingungen also zur Regeneration der Reduktionsäquivalent-
Transportmoleküle verbraucht wird, kann es unter aeroben Bedingungen in einen weiteren
Stoffwechselweg eingeschleust werden. Dabei handelt es sich um den
Tricarbonsäurezyklus, der nach seinem Entdecker auch Krebszyklus oder nach einem
charakteristischen Metaboliten auch Citratzyklus genannt wird. Er ist in fast allen
Organismen vorhanden und dient als zentrale Stoffwechseldrehscheibe, da von ihm
zahlreiche andere Stoffwechselwege ausgehen. Das aus der Glycolyse stammende Pyruvat
wird ebenfalls zuerst decarboxyliert und der entstandene C 2 -Körper mit einem aus dem
Zyklus stammenden C 4 -Körper zum Citrat verbunden (s. Abb. 3.10). Diese Tricarbonsäure
wird im Anschluß daran unter Bildung zahlreicher Reduktionsäquivalente und unter
Energiegewinn in mehreren enzymatischen Schritten wieder zu dem o. g. C 4 -Körper
abgebaut. Die dabei gebildeten Reduktionsäquivalente können ebenfalls in die

Einführung in die Biotechnologie - 24 - Scheper, TCI Hannover
Atmungskette eingeschleust werden. Dadurch ergibt sich insgesamt ein im Vergleich zur
Gärung 19mal höherer Energiegewinn.
Bisher wurde immer abstrakt von Energiegewinn gesprochen. Sowohl bei Pro- als auch
bei Eukaryonten wird diese Energie meist in Form von Adenosintriphosphat (ATP) gespeichert,
welches das zentrale Molekül des Energiestoffwechsels ist (Abb. 3.17). Bei der
Hydrolyse des ATP zum ADP (Adenosindiphosphat) wird nämlich eine große Menge an
Energie freigesetzt, die für viele Stoffwechselreaktionen genutzt werden kann. Das ADP
kann anschließend einerseits durch Prozesse der Atmungskette, anderseits aber auch durch
Reaktion mit energiereicheren Stoffwechselzwischenprodukten wieder phosphoryliert
werden. Eine Spaltung zum Adenosinmonophosphat unter Energiegewinn ist ebenfalls
möglich.
Nach diesen einführenden Absätzen zum mikrobiellen Stoffwechsel, der in anderen
Kapiteln aufgegriffen und vertieft werden wird, soll noch ein weiterer Aspekt des
Wachstums beschrieben werden, nämlich der der Zellvermehrung.
NH 2
N
O O O
N
- O P O P O P O CH2 N
O N
O - O - O -
H H
Triphosphat H H
HO OH
Adenosin = Ribose + Adenin
Abb. 3.17 Strukturformel des Adenosintriphosphats
Zellvermehrung
Prokaryonten vermehren sich
überwiegend durch einfache
Zweiteilung, wobei erst kurz vor dem
Teilungsprozeß die DNA des
„Bakterien-Chromosoms“ dupliziert
wird (s. Kap. 1.1). Es sind also
Haplonten. Demgegenüber gibt es bei
den Eukaryonten zum Großteil
Dikaryonten mit Ausnahme der Pilze,
wo die Verhältnisse vielfältiger sind (s.
Kap. 1.3.1).
Die Zellkerne von Protozoen, Algen
bis hin zu den höheren Säugetieren, die des Menschen eingeschlossen, führen eine Teilung
durch, die als Mitose bezeichnet wird und die der Zellteilung vorausgeht. Normalerweise sind
die Chromosomen eines Zellkerns nicht voneinander zu differenzieren, erst zu Beginn der
Mitose kontrahieren sie sich und werden mikroskopisch sichtbar. Die Chromosomen, die die
Form eines X annehmen, bestehen dann aus zwei identischen Einheiten, den Chromatiden,
die an einer speziellen Stelle, den sogenannten Centromeren (oder Kinetochoren)
zusammengehalten werden. Während des Kontraktionsvorganges verschwindet die Kernmembran
und die Kernteilungsspindel entsteht. Ihren Ursprung hat sie an den sogenannten
Centriolen, die sich nun, nachdem sie sich aus einem einzigen herausgebildet haben, an den
verschiedenen Polen des Kerns befinden. Die Chromosomen ordnen sich sodann in der
Äquatorebene an, die Fasern der Kernteilungsspindel heften sich an die Centromere an und
ziehen die Chromatiden an die entgegengesetzten Enden des Kerns. Dies ist ein
hochgeordneter Prozeß, jede Seite erhält einen identischen Satz an Chromatiden.
Anschließend entspiralisieren sich diese, die Kernmembran bildet sich wieder aus und
parallel dazu haben sich auch die Zellorganellen verdoppelt. Der Zellteilungsprozeß schließt
dann mit der Durchschnürung der Mutterzelle ab, wobei die zwei Tochterzellen gebildet
werden (s. Abb. 3.17). Bis zur nächsten Mitose muß die DNA wieder verdoppelt werden.

Einführung in die Biotechnologie - 25 - Scheper, TCI Hannover
Etwas komplizierter sind die
Verhältnisse bei der Meiose (Abb.
3.18). Zu Beginn verfügt die
Ausgangszelle über den doppelten
Chromosomensatz, ist also diploid;
am Ende des Prozesses, der zwei
Teilungen einschließt, sind die vier
entstandenen Zellen haploid. Im
Prinzip paaren sich zuerst die
homologen Chromosomen, wobei
DNA-Stücke ausgetauscht werden
können. Anschließend werden nun die
ganzen Chromosomen, also die zwei
Chromatiden mit dem Centromer, an
unterschiedliche Enden befördert. Da
nun die Chromosomenzahl je
Tochterzelle halbiert wurde, wird
diese erste Teilung auch als Reduktionsteilung
bezeichnet. Erst im
Anschluß findet die zweite Teilung
statt, die mit der der Mitose
vergleichbar ist und zur Trennung der
zwei Chromatiden eines Chromosoms
führt. Neben der Reduktion der
Chromosomenzahl findet bei der
Meiose auch eine Neukombination
Abb. 3.19 Mitose des Erbmaterials statt. Die
entstandenen haploiden Zellen
können nun mit ebenfalls haploiden
Zellen eines anderen Organismus der gleichen Art zu einer
diploiden Zelle verschmelzen, wobei eine Zygote entsteht,
aus der ein neuer Organismus mit neukombinierten Genen
hervorgeht.
Abb. 3.18Meiose

Einführung in die Biotechnologie - 26 - Scheper, TCI Hannover
4. Prozeßtechnik
4.1. Reaktortypen
Grundtypen:
Satzreaktor
Batch Reactor
Durchflußrührkessel
CSTR
Continuous Stirred Tank Reactor
Strömungsrohr
PFR
Plug Flow Reactor
Abhängigkeit von der Zeit (t)
Abhängigkeit vom Ort (z)
typische Kenngrößen: τ = V [min] hydrodynamische Verweilzeit
V &
D
V & 1
= =
V τ
Verdünnungsrate
U = c ° - c Umsatz (zwischen 0 und 1)
Spezielle Reaktortypen:
1) Kreuzstromreaktor
c o
Kreuzstromreaktor (z.B.: pH konstant halten; dosierte Substratzugabe bei
Substratinhibierung in Enzymreaktoren)
2) Blasensäulenreaktoren

Einführung in die Biotechnologie - 27 - Scheper, TCI Hannover
Vorteil: keine mechanisch bewegten Einbauten (Rührer) oder Flüssigkeitspumpen (Energieeintrag)
Im Mammutsäulenreaktor werden die Dichteunterschiede zwischen begastem und
unbegastem Medium ausgenutzt, um eine Strömung zu erzeugen.
Arbeitsweise
Betriebsart Vorteile Nachteile
Satz
kontinuierlich
halbkontinuierlich
- billig
- flexibel
- hohe Umsätze, da definierte Reaktionszeiten
- wenig Infektionen und Mutationen,
da kurze Kultivierungszeiten
wann sinnvoll?
- geringe Produktmenge nötig
- wechselnder Anwendungsbereich
- hohe Infektionsgefahr
- Totzeiten
- häufiges Sterilisieren
- häufiges Animpfen
- hohe Lohnkosten
- Gefahr für Bedienungspersonal,
da häufiges Öffnen und
Schließen des Reaktors
- Mutationsgefahr
- nur diskontinuierliche
Aufarbeitung möglich
Vor- und Nachteile ergeben sich aus dem Obigen.
Mutationen können zur Stammselektion genutzt werden
Kombination beider Prozeßweisen:
hier ist Trennung zwischen Wachstum und Produktbildung möglich !!
Betriebsweise von Reaktoren: - diskontinuierlich
- kontinuierlich
- Zufütterungssatzbetrieb (fed batch)
4.2Beschreibung von Reaktoren
Die Konzentration einer Komponente im Volumenelement eines Reaktors wird bestimmt
durch:
⎡differentielle
⎤
⎢
Konzentrations -
⎥ erzwungene
+ effektive
⎢
⎥
= ⎡ [ ]
Konvektion Diffusion
+ Reaktion
⎣⎢
ä nderung ⎦⎥
⎣ ⎢ ⎤ ⎡ ⎤
⎥ ⎢ ⎥
⎦ ⎣ ⎦
Mathematisch läßt sich diese Beziehung als Bilanzgleichung formulieren:
∂c
∂t
r r
= - div (u c ) - div ( j ) + υ r
∑
i i i ij

Einführung in die Biotechnologie - 28 - Scheper, TCI Hannover
∂c
∂t
oder
r
= - div (u c ) + div (D grad c ) + R
i
i
i
Durch mathematische Operationen, die die Kenntnis der Kinetik der interessierenden
Reaktion sowie des dynamischen Verhaltens des betrachteten Reaktors voraussetzen, lassen
sich sogenannte Design-Gleichungen herleiten. Sie ergeben im einfachsten Fall einen
Zusammenhang zwischen der Reakionszeit und dem erzielbaren Umsatz.
4.3. Ideale Reaktoren
Idealer Satzreaktor (Rührkesselreaktor, batch reactor)
Die Bilanzgleichung lautet:
dc
= - 0 + 0 + R = R
dt
angewandt auf die einfache Reaktion A → B (Reaktion 1. Ordnung) ergibt sich mit
dca
=− kca
und U c 0
c a
−
a
ca
dca
= = 1 − : dU =−
0 0
dt
c c c 0
0
−ca
dU
dU
( 1− U)
= −k c a
dt
0
= −kc a
(1- U)
= k dt
1
ln
( 1− U )
= k t t = 1 k ln 1
1− U
dt
Dabei ist t die Zeit, die nötig ist, um unter gegebenen Bedingungen einen bestimmten
Umsatz zu erreichen.
a
a
a
Ideales Strömungsrohr (plug flow reactor)
(Beispiel: eine Fläche S wird in einer Richtung durchströmt; u ist der Betrag der Strömungsgeschwindigkeit).
Die Bilanzgleichung hat die Form:
d( u c )
− + R dx
u dc i
dx = R
u S dci
S dx
= R
&V
dc i
= = R
dV
mit dU = − dc i
c i
0

Einführung in die Biotechnologie - 29 - Scheper, TCI Hannover
dU
dV = − R 0
c i
V&
Durch Integration erhält man:
c
0
i
U
V & dU
∫ = dV
−R
∫ = V
0
V
0
τ = c
0
i
U
∫
0
dU
−R
Idealer Durchflußrührkessel (continuous stirred tank reactor)
Die Bilanzgleichung erhält die Form:
dj
0 = div( { u
r c)
+ R = − z + R
=j
dz
Diese Betrachtungsweise ist so möglich, da bei der Eintrittsfläche ein Konzentrationssprung
stattfindet (Annahme spontaner und vollständiger Durchmischung).
Die Bilanzgleichung kann dann in der folgenden Weise geschrieben werden:
jaus − jein
0 = −( ) + R
L
u
= − ( − +
L c c R
aus ein
)
F u
= − c − c + R
aus ein
F L ( ) = − V& ( c − c ) +
aus ein R
V
τ R = ( c − c )
aus
τ R = −U c ein
ein
mit: U c 0
− c ( cein
− caus)
=
0 =
c c
ein
folgt dann:

Einführung in die Biotechnologie - 30 - Scheper, TCI Hannover
U = − τ R
c ein
4.4. Reale Reaktoren
Das Verhalten realer Strömungsrohre und Rührkesselreaktoren läßt sich durch Verknüpfung
sich ideal verhaltender Reaktoren modellieren. Gebräuchlich sind:
- Kaskadenmodell
- Dispersionsmodell
Wertvolle Rückschlüsse darauf, welches Modell zur Anwendung kommt, liefert das
Verweilzeitverhalten realer Reaktoren.
5. Wachstum im Bioreaktoren
5.1. Kinetik des Wachstums
Die Formalkinetik setzt sich zusammen aus den biologischen Reaktionen in den Zellen und
der reaktionstechnischen Kinetik (Stofftransport etc.). Sie beschreibt das komplexes
Zusammenspiel zwischen Reaktor und Zellbiologie.
Formalkinetik des Zellwachstums und der Produktbildung
Man muß kennen: - Reaktortyp
- Stamm
- physiologischer Zustand
- Vorgeschichte/ Vorkultur
- Morphologie
- Umwelt
Modelle, die dieses Wissen umfassen, bezeichnet man als strukturierte Modelle. Bei
undefinierten Bedingungen wird das Geschehen mit unstrukturierten Modellen als Funktion
der Prozeßvariablen (Substrat, Produkt, etc.) beschrieben, die Zellen sind "black boxes".
In realen Systemen wird eine modellmäßige Erfassung immer schwieriger: Phänomäne wie
Mutationen oder Plasmidverlust können nur mit sehr komplexen strukturierten Modellen
erfaßt werden.
Basisgrößen zur Beschreibung der Formalkinetik des Zellwachstums sind
Zellmassenkonzentration: X
Zellzahlkonzentration: n
Unbeschränktes Wachstum heißt: Vermehrung erfolgt durch Zweiteilung:
0 1 2 m m+1
2 ; 2 ; 2 ;...; 2 ; 2 Zellen
Es gilt: bei t = t 0
sind n 0
Zellen vorhanden
bei t = t' haben sich m Teilungen ergeben und n Zellen sind vorhanden mit
n = n
0
2 m
Auflösen nach m durch Logarithmieren ergibt die Anzahl der Teilungen in der Zeit
zwischen t 0
und t':
m = log n− log n0
log2

Einführung in die Biotechnologie - 31 - Scheper, TCI Hannover
⎛ m
Die Zahl der Teilungen m pro Zeiteinheit bezeichnet man als die Generationszeit ⎟ ⎞
⎜ .
⎝ t' −t
0 ⎠
Da die Zellmassenkonzentration von Interesse ist, gilt:
R X
= dX
dt
= µ X mit: R X
= Wachstumsgeschwindigkeit
dX
dt
= Änderung der Zellmassenkonzentration mit der Zeit
µ = spezifische Wachstumsgeschwindigkeit
5.2. Ungehindertes Wachstum
Die Wachstumsgeschwindigkeit ist für eine ungehindert wachsende Kultur konstant, so daß
gilt:
µ = dX
dt
⋅ 1
X
Auch hier kann man X 0
als Anfangskonzentration wählen (t = 0: X = X 0
):
Dann folgt:
dX
= µ dt
X
X
dX
∫ = µdt
X
∫
X
0
t
0
lnX X
X0 = µ t
ln X X 0 = µ t
X = X 0 e µ t exponentielles Wachstumsgesetz
Man definiert analog zur Halbwertszeit des radioaktiven Zerfalls eine Verdopplungszeit t D ,
nach der sich die Zellkonzentration verdoppelt hat:
2X
0 0 e t D
= X µ
t D
= ln2
µ
Diese Verdopplungszeit wird bei Zweierteilung auch Generationszeit genannt.
(Alles läßt sich auch analog für die Zellzahlkonzentration n als Zellzahl pro Volumen
sagen.)
5.3 Reales Wachstum
(Am Beispiel einer Satzkultur)
Oben Genanntes gilt nur für unlimitiertes Wachstum. In der Realität läßt sich eine
Satzkultur in Einzelschritte unterteilen (Definition 'Satzkultur' kommt später noch einmal):

Einführung in die Biotechnologie - 32 - Scheper, TCI Hannover
Trägt man die Zellmassenkonzentration (d.h. Zellmasse ) gegen die Zeit auf, erhält man 7
Volumen
Abschnitte.
Als Randbedingungen sind zu beachten: Einfacher Organismus, ein Substrat (dieses
limitiert, sobald es verbraucht ist).
Wichtig ist, daß sich die Lebensbedingungen der Zellen hier mit der Zeit ändern, d.h. die
Wachstumsgeschwindigkeit ändert sich.
zu : Lag-Phase
Durch Umsetzen in eine andere Umgebung wird das Zellwachstum zuerst stark
verlangsamt. (Neue Substrate, andere Verdünnung, pH-Wert-Änderung, Scherbeanspruchung,
Zellen kommen evtl. aus der Ruhephase der Vorkultur).
Die Zellen sollten daher nach Möglichkeit so überführt werden, daß diese Effekte
nicht zu gravierend sind. Die Lag-Phase ist je nach Bedingungen unterschiedlich lang.
Die Zellzahlkonzentration n ändert sich kaum, wohl aber die Zellmassenkonzentration
X (RNA- und Proteinproduktion).
zu : Die ersten Zellen beginnen, sich "normal" zu teilen. Diese Phase dauert solange, bis
alle Zellen in die exponentielle Wachstumsphase übergegangen sind.
zu : Exponentielles Wachstum
Hier liegt nicht limitiertes Wachstum vor. Alle Zellen wachsen schnellstmöglich. Die
maximale Wachstumsrate µ max ist erreicht.
In dieser Phase gelten die Gesetze des unlimitierten Wachstums (s.o.) streng!
Es gilt aber allgemein: µ = f(t)
zu : hier beginnt sich die Substratkonzentration so zu verringern, daß Limitierung einsetzt.
Evtl. wirken sich auch Stoffwechselprodukte hemmend aus. Zelltod tritt ein. Das
Zellgewicht der einzelnen Zellen nimmt ab, da Speicherstoffe abgebaut werden. Oft ist
die Teilungsrate noch groß, sodaß das Zellgewicht kleiner wird. Die Zellzahlkonzentration
erscheint daher länger in der exponentiellen Phase als die Zellmassenkonzentration.
zu : stationäre Phase
Geschwindigkeit der Vermehrung und des Absterbens sind gleich. Zellzahl erscheint
nach außen konstant. In dieser Phase sind die maximale Zellmassenkonzentration und
Zellzahlkonzentration erreicht.

Einführung in die Biotechnologie - 33 - Scheper, TCI Hannover
zu : Allmählich überwiegt die Absterberate. Zellmassen- und Zellzahlkonzentration
sinken.
zu : Hier beginnt die exponentielle Absterberate, bei der eine bestimmte
Absterbegeschwindigkeit erreicht wird.
5.4. Zellwachstum und Produktbildung
Substratverbrauchsraten
Bestimmt man bei einer Satzkultivierung die Zellmassen- und die Zellzahlkonzentrationen,
als Funktion der Zeit, erhält man die einzelnen Wachstumsphasen. Auch der RNA- und DNA-
Gehalt können zur Beurteilung des Kultivierungsprozesses herangezogen werden. Oft
komplizierter, aber interessanter sind die Substratverbrauchs- und Produktbildungsraten. Zu
deren Bestimmung zieht man das essentielle Substrat oder das typische Produkt heran.
Substratverbrauchsrate:
1) keine Produktbildung:
Wird kein Produkt gebildet, laufen die Änderungen der Substratkonzentration und der
Zellmassen- und Zellzahlkonzentration parallel.
2) Keine größeren Mengen an Produkten werden gebildet:
Dann gilt für die Zellmassenkonzentration X:
1
dS 1 dX
− RS
= R X
⇒ − =
YXS
/
dt Y XS /
dt
R X : Bildungsrate von Biomasse
−R S
: Substratverbrauchsrate
S: Substratkonzentration
dX
YXS
/
=− ist hier ein Ausbeutekoeffizient in Bezug auf das
dS
Substrat. Er gibt an,wieviel Biomasse aus wieviel Substrat gebildet wird:
großes Y XS /
heißt kleines (−R S
) bei konstantem R X
. Wächst
Y XS /
, so sinkt (−R S
) weiter.
Für die Zellzahlkonzentration gilt analog:
1
− RS
=
Y
und
nS /
R n
dn
YnS
/
=−
dS
Das Zellwachstum kann man auch in seinen verschiedenen Phasen in einem X-D-Diagramm
(D = Verdünnungsrate) bei einer kontinuierlichen Kultur betrachten. (siehe weiter unten)

Einführung in die Biotechnologie - 34 - Scheper, TCI Hannover
5.5. Produktbildung
Einteilung nach GADEN
TypI:
Die Produktbildung hängt vom Substratverbrauch ab und ist diesem weitgehend
proportional. Primärmetabolite werden gebildet, (d.h. Produkte, die durch indirekte
Substratoxidation gebildet werden: z.B. Ethanol (vgl ), Milchsäure (vgl.), Gluconsäure
aus Glucose (vgl.))
Aus Glukose können gebildet werden:
Ethanol:
Milchsäure:
Gluconsäure
Glukose
Glukose
Glykolyse
⎯⎯ ⎯ → Ethanol
Glykolyse,
Milchsäuregärung
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ → Lactat
CHO
COOH
HO
OH
OH
OH
CH 2 OH
Oxidation
durch GOD
CH 2 OH
O
OH
HO
OH
O
HO
OH
OH
OH
CH 2 OH
Glukose
Gluconolacton
Gluconsäure

Einführung in die Biotechnologie - 35 - Scheper, TCI Hannover
Beispiel für Typ I der
Produktbildung nach Gaden:
Alkoholproduktion
a) Zellmassen- und
Produktkonzentration und
verbrauchtes Substrat
b) Wachstums-,
Produktbildungs- und
Substratverbrauchsgeschwin
digkeit
c) spezifische
Geschwindigkeiten als
Funktion der Zeit
R X , R S und R P sind auch ähnlich:
µ = R
δ = R
π = R
X / X
S / X
P / X
⎫
⎪
⎬ spezifische Geschwindigkeiten
⎪
⎭
Typ II
Produktbildung hängt vom Substratverbrauch indirekt ab:
Das Produkt entsteht indirekt aus dem primären Energiestoffwechsel. Daraus ergibt sich
eine indirekte Abhängigkeit:
Beim Verlauf der spezifischen Raten wird deutlich, daß Wachstum und Substratverbrauch
eng zusammenhängen. In der Wachstumsphase ist die Bildung des Produktes auch noch
gering. In der Produktphase sind der spezifische Substratverbrauchs- und die spezifische
Produktbildungsgeschwindigkeit sehr ähnlich, hier also gekoppelt. Wachstum zeigt "kleines"
Maximum.

Einführung in die Biotechnologie - 36 - Scheper, TCI Hannover
Beispiel für Typ II der
Produktbildung nach Gaden:
Zitronensäureproduktion
a) Zellmassen- und
Produktkonzentration und
verbrauchtes Substrat
b) Wachstums-,
Produktbildungs- und
Substratverbrauchsgeschwin
digkeit
c) spezifische
Geschwindigkeiten als Funktion
der Zeit
TypIII
Produktbildung hängt nicht vom Substratverbrauch ab. Hierzu gehören die komplexen
Produkte Antibiotika, Vitamine etc. Sie werden oft auch Sekundärmetabolite genannt. Hier
kann man klar in die Wachstums- und Produktionsphase unterteilen.
Wachstumsphase:
X
Substrat
Produkt
X
Hier gibt es eine enge Kopplung zwischen Substratverbrauch und Biomasse; es wird
kaum Produkt gebildet.
Produktionsphase:
Produkt wird gebildet. Wachstum und Substratverbrauch sind gering, das spez.
Wachstum kann sogar negativ werden.
t

Einführung in die Biotechnologie - 37 - Scheper, TCI Hannover
Beispiel (veraltet * ) für Typ III
der Produktbildung nach
Gaden: Penicillinproduktion
a) Zellmassen- und Produktkonzentration
und
verbrauchtes Substrat
b) Wachstums-, Produktbildungs-
und Substratverbrauchsgeschwindigkeit
c) spezifische Geschwindigkeiten
als Funktion der Zeit
6. Modelle
6.1. Nichtstrukturierte, verteilte Modelle
Die Berechnung erfolgt aufgrund von durchschnittlichen Eigenschaften der Zellen und der
Annahme einer homogenen, nicht segregierten Verteilung der Biomasse. Die Zellen werden
nur durch die Zellmassenkonzentration X charakterisiert. Also haben zwei Kulturen mit
gleichem X die gleiche biologische Aktivität.
Dies gilt nur für balanciertes Wachstum, d.h. alle extensiven Eigenschaften des wachsenden
Systems ändern sich in Abhängigkeit von der Zeit in gleicher Weise.
extensive Größen: Gewicht, Volumen, Energie
(ändern sich bei Aufspaltung des Systems)
intensive Größen: Temperatur, Dichte, Druck
(ändern sich nicht bei Aufspaltung des Systems)
Ein balanciertes Wachstum wird in der Regel in gut durchmischten CSTR erreicht, nicht
jedoch in Blasensäulen, da diese Segregation zeigen. In Blasensäulen ändern sich die
extensiven Eigenschaften entlang des Reaktors und zusätzlich mit der Zeit (Schwankungen).
Nichtstrukturierte Modelle ergeben für jeden Reaktor mit verteilten Parametern andere
Ergebnisse.
* Erwähnt nur, um das Prinzip zu zeigen. In Wirklichkeit ist Penicillin kein Sekundärmetabolit.

Einführung in die Biotechnologie - 38 - Scheper, TCI Hannover
6.2. Strukturierte Modelle
Sie enthalten Informationen über den Zellzustand, z.B. über Schlüsselkomponenten (ATP,
DNA). Besser wäre noch eine genaue Beschreibung der Zellregulation.
(Am Beispiel eines einfachen Modells.)
Biomasse wird strukturiert, d.h. kompartimentiert; z.B. nach synthetischen Komponenten
(RNA, Vorstufen) und strukturellen Komponenten (DNA, Proteine). Alle Reaktionen und
Transportvorgänge haben eine bestimmte Geschwindigkeit (Sekunden bis Stunden). Wichtig
ist die Korrelation dieser Geschwindigkeiten mit denen im Bioreaktor, also der
Zellumgebung. Wenn sie im Vergleich zu den äußeren Änderungen sehr schnell sind, sind
diese Vorgänge stets im Gleichgewicht. Langsame Vorgänge (z.B. genetische Verändrungen)
können als "eingefroren" betrachtet werden. Nur wenige interne Vorgänge haben ähnliche
Zeitkonstanten wie die äußeren.
Beispiel: Das 2-Komponenten-Modell
Ein synthetischer Anteil (Komponente 1) entsteht durch Substratverbrauch (S) mit dem
Masse Komponente 1
Ausbeutekoeffizienten Y
Substratmasse
. Die Bildung der Komponente 1 ist in Bezug auf
die Zellmasse X und die Substratkonzentration [S] 1. Ordnung.
Die Komponente 2 wird als struktureller, genetischer Anteil betrachtet, der mit einer Rate
Masse Komponente n
1 aus Komponente 1 hervorgeht. Die Rate ist proportional ρ 1 ρ 2 (ρ n =
).
Einheitvolumen der Zelle
Die Verdopplungszeit der Komponente 2 ist notwendig und hinreichend für die
Zellteilung. Folglich ist die Zellzahldichte proportional zur Dichte der Komponente 2 im
Medium.
Biomasse besteht aus den beiden Komponenten.
Es gilt:
Komponente 2
Komponente 1
dρ
dρ
1
2
dS
dt
dX
dt
= K
( ρ1 + ρ2)
− K2 ρ1ρ 2 − µρ
142443
142
34 { 1
Zellbildung
Zellmassenbildung
Umsatz zu ρ
1
S
=−1 Y K S X aus
1
= K 1
S X aus
Wachstum
ρ 1 entsteht nur aus [S] bei

Einführung in die Biotechnologie - 39 - Scheper, TCI Hannover
df2
dt
dρ
dt
1
= K ρ ρ − µρ mit µ = K 1 S ρ 2 entsteht nur aus [ρ 1 ]
f
2
2 1 2 2
Da µ = K 1 S und ρ 1 +ρ 2 = ρ c = const. gilt:
= ρ , alsoAnteile der Komponente 2 an der Zelle.
ρ2
=− K S f + ( K ρ ) f ( 1−f
)
1 2 2 2 2 2
c
6.3. Das Monod-Modell
Ein einfaches Beispiel der nichtstrukturierten verteilten Modelle ist das Monod-Modell für
das Substrat.
Bedingung: limitiertes Wachstum (sonst gelten die Gesetze für die nichtlimitierte
exponentielle Wachstumsphase)
Für Einzeller gilt:
S
µ = µ m
entsprechend der Enzymkinetik; S = limitierender Stoff
S+KS
und damit
S
R = dX
=
X
X
µ X= µ
m
.
dt
S+KS
Man unterscheidet zwei Grenzfälle:
1.) S >> K S : ⇒ µ ≅ µ m
. Damit ist R X unabhängig von S und entspricht formal einer
Reaktion nullter Ordnung.
S
dX
S X
2.) S

Einführung in die Biotechnologie - 40 - Scheper, TCI Hannover
Die spezifische Geschwindigkeit µ nimmt dann mit steigendem X ab.
Es gibt auch kompetitve und nicht kompetitive Produktinhibierung:
1.) kompetitive Inhibierung:
X S
Substratreaktion: X + S (XS) K =
(XS)
Inhibierung: X + J (XJ) K
Produktbildung: (XS) P + X
J =
X J
(XJ)
Geschwindigkeitsbestimmend ist: R P = k [(XS)] = - R S
Die spezifische Substratverbrauchsgeschwindigkeit ist:
−RS dS 1
S 1
=−
= µ
m
X + (XS) + (XJ) dt X + (XS) + (XJ) S + α1 KS YX/S
1
mit: α 1
= 1+
KJ
Man erkennt: K S wird um α erhöht, µ m wird durch die Inhibierung also nicht beeinflußt.
Andere Inhibierungen gemäß der Enzymkinetik:
Werden mehrere Substrate genututzt werden können, müssen diese in die Kinetik
einbezogen werden.
Beispiel: Für Proteus vulgaris wurden mehrere exponentielle Wachstumsphasen gefunden.
Folglich dienen mehrere Substanzen im Medium (Hefeextrakt) als Substrat.
ln X
ln X
S 2
S 1
t
6.4. Wachstum im gerührten Satzreaktor
1.) nicht limitiert:
R X =µ m
X
Anfangsbedingungen: X= X
bei t = 0
integriert:
0 µ⋅
X= X ⋅e t
R X hängt weder von Substrat- noch von der Sauerstoffkonzentration ab ⇒ Reaktion formal
nullter Ordnung in bezug auf Substrat und Sauerstoff.

Einführung in die Biotechnologie - 41 - Scheper, TCI Hannover
dS
Der Substrat- und Sauerstoffverbrauch ist: − RS
= − = µ
m
X 1 dt YXS
/
dO
− R O
= − = µ X 1
m
dt YX/O
(Gilt nur, wenn nicht begast wird !)
2.) limitiert:
dX S X
Anfangsbedingung:
R = = µ
m
dt K
S
+ S
dS S
Substrat- und Sauerstoffverbrauch: − RS
= − = µ
m
dt S+K X 1
S
YXS
/
dO S
− RO
= − = µ
m
dt S+K X 1
S
YXO
/
(Gilt nur, wenn nicht begast wird !)
6.5. Wachstum im CSTR
1.) nicht limitiert:
mit zellfreiem Medienzulauf folgt aus der Beziehung
dX1
= µ
m
X1−D(X1−X 0)
dt
Unter der Annahme:
dX
= 0 stationärer Zustand
dt
X 0
= 0 gilt mit D = 1 τ (Verdünnungsrate):
0 = µ m
⋅ X1− D⋅
X1
D =
Die Beziehung für das Substrat lautet dann:
dS
1
= D (S0-S 1) -
dt
YX/S
µ X
mit Begasung.
dO
1
*
= D ⋅ ( O 0
− O 1 ) − ⋅ µ
m
⋅ X + kL
⋅a
1
⋅( O − O1)
dt 1 42
44 3 Y
1442
443
Sauerstoffgehalt im
Einlauf
X / O
Unter stationären Bedingungen gilt:
dS dO
= = 0
dt dt
Umschalten von Satzbetrieb auf kontinuierlichen Betrieb:
µ m
Begasung
m 1

Einführung in die Biotechnologie - 42 - Scheper, TCI Hannover
3
X 1
2
X 0 1
X geht gegen Null, wenn µ m X 1 < D (X 1 - X 0 )
2.) CSTR mit Substratlimitiertung
dX
dt
dS
dt
1
1
dO
dt
1
µ m X 1 = D (X 1 - X 0 )
stationär: Bildungsrate = Austragsrate
µ m X 1 > D (X 1 - X 0 )
weiteres Anwachsen, bis Limitierung erreicht wird.
= µ
m
=−µ
S1
K S X D(X X )
1+ 0
−
1
+
m
=−µ
m
S 1
S1
K S X 1
1
+ Y
S 1
X/S
S1
K S X 1
1
+ Y
S 1
X/O
+D(S − S )
0 1
*
+D(O − O ) + k a(O −O )
0 1 L
Der stationäre Zustand ist stabil, wenn Substratlimitierung vorliegt. Wird X kurzfristig
größer, fällt S und R X und X sinken wieder ab.
Ist: X 0 = 0 gilt im stationären Zustand
S
1S
0 = µ m 1S
KS
+ S X -X D 1S
1S
0 µ
1
X1 -X1S
D= X1S
µ
1
=
S
( − D)
µ 1 = D stabiler Arbeitspunkt
1
Für den Substratverbrauch gilt:
Da µ 1 = D ist, ergibt sich:
aus µ = µ
1
m
S1
S
K + S
S
1S
X
µ1 1S
1
Y
folgt
X/S
=D(S0 − S 1S)=D
S
1S
⋅X 1
S
Y /
XS
KS
D
= wenn S 0
> S 1S
µ -D
Mit (I) ergibt sich weiter:
⎡ K S D ⎤
X 1S = Y X/S (S0 − S 1S) = YX/S ⎢S0
− ⎥
⎣ (µ m − D) ⎦
m
(I)

Einführung in die Biotechnologie - 43 - Scheper, TCI Hannover
X
S 0= A
S = B 0
Produktivität
S S
D c
1
D
D c ist die kritische Verdünnungsrate, da hier das µ max der Zellen erreicht ist. Die Zellproduktivität
erreicht ihr Maximum bei D ≈ D c :
⎡ K S D ⎤
R = D X1S = D YX/S ⎢S0
− ⎥
⎣ (µ m − D) ⎦
7. Zellrückhaltung
Probleme ergeben sich bei kontinuierlichen Reaktoren, wenn die gewünschte
Verdünnungsrate grösser sein sollte al die maximale spezifische Wachstumsrate. Dieses
Problem kann durch Zellrückführung gelöst werden.
Es gibt prinzipiell 3 Arten der Zellrückhaltung
a) Innerer Filter
b) Sedimentation
c) Trenneinheit (äußerer Filter, Separation)
7.1. Innerer Filter
V
X,
0
S0 αV, S e , X
e
(1- α)V, S , βX
e
e
V, X, S
R e e
Anteil entnommen: α mit 0

Einführung in die Biotechnologie - 44 - Scheper, TCI Hannover
dX
dt
e
⋅ V
R
= V&
⋅X
0
− α⋅V&
⋅X
e
−
( 1−α) ⋅V&
⋅β⋅X
e
+ R
x
⋅VR
rein Auslauf Filter Reaktion
stationär: R = [( α + ( 1− α)
⋅β)
⋅ X − X ]
x
1
τ
Annahme: α = 0 (alles geht durch das Filter)
A⋅X
e
X
0
R
x
= −
τ τ
mit A = α + (1 - α) · β
wenn β = 0 und X 0
= 0 (zellfrei)
dann A = α
R
x
= µ = D⋅A
X
e
D =
µ
A
wenn α = 1 D kann maximal µ max
werden
α < 1 D kann größer werden
e
0
7.2. Sedimentation
S0
X
0
V
Mischer
(V + V R)
Überlauf
Settler
(1- α)V, βX e
, S e
zellarmer Abfluß
S e
Rücklauf
V,
R
δ X,S
e e
Ablauf
αV, S,
e
δX e
zellreicher Abfluß
Hier gilt:
V & geht rein und V & geht raus, τ über System ist daraus bestimmbar
V & wird recycled
R
X
δ =
X
Rück
e
allg. > 1
V&
, α =
V&
Ablauf
und
β
wie vorne

Einführung in die Biotechnologie - 45 - Scheper, TCI Hannover
dX
dt
e
V
Reaktor
0
( 1− α) V&
βX
e
− α V δ X
e
+ R
x
VReaktor
= V&
X −
&
Ein solches System stellt beispielsweise die Reaktion in folgender Abbildung dar.
(1 - α)V
S, βX
e
e
S e
Höhe
βX e
Sedimentationssäule
Lochplatte
X e
CSTR
V, S 0, X0 αV, S , X
e
e
S e
X0
S 0
X
7.3. Trenneinheit (äußerer Filter, Separation)
V,
R
βX e
= XR
V, X 0
V + V R V + V R
Permeat
V, X aus = nXe
X e
Filter
X
Es gilt: β =
X
X
aus
n =
X
e
V&
R
α =
V&
Bilanz über Trenneinheit:
R
e

Einführung in die Biotechnologie - 46 - Scheper, TCI Hannover
( V&
+ V&
) ⋅X
= V&
⋅β⋅X
+ n⋅X
⋅V&
R
Gesamtreaktor:
dX
⋅ V = V&
⋅X
+ V&
dt
e
R
⋅
⋅
e
+
0 R
β X
e
R
x
V VR
β X
e
e
⋅
−
&
8. Begasung von Biokomponenten und Sauerstoffübertragung
⋅
⋅
Der Sauerstoffverbrauch hängt von verschiedenen Faktoren ab:
- Zellen, die sich teilen ("junge Zellen"), benötigen mehr Sauerstoff
Der O 2 -Verbrauch ist deshalb in der exponentiellen Wachstumsphase am größten.
- Oberfläche des Organismus:
erlauben mehr O 2 -Aufnahme als
unzugängliche
Bereiche
- Ionen-, Substrat- und Additivkonzentrationen verändern die Löslichkeit.
Die Beziehung für den Sauerstoffverbrauch (hier steht O für O 2
) muß nun die äußere
Begasung berücksichtigen. Sie lautet nunmehr:
dO
1
= DO (
0
−O1) − µ
mX1+ kLa( O0 −O1)
dt
Y 1442443
XO /
Begasung
Dabei ist k L der auf die Flüssigphase bezogene Stoffübergangskoeffizient. Er umfaßt die
Transportphänomene, die beim Übergang eines Sauerstoffmoleküls von der Gasphase in die
Zelle wirksam werden. Sie sind in der folgenden Darstellung veranschaulicht:
4
Gasblase
5
2
1 7
6
3
Zelle
Diffusion vom Kern zur Phasengrenze
Durchgang durch Phasengrenze
Diffusion durch Film/ Grenzschicht

Einführung in die Biotechnologie - 47 - Scheper, TCI Hannover
Transport durch Flüssigkeit
- entspricht bis
Für den Phasenübergang der gasförmigen Komponente A (also beispielsweise Sauerstoff) von
gas → flüssig gilt:
Das Henrysche Gesetz beschreibt:
Im Gleichgewicht ohne Sauerstoffverbrauch gilt:
Die Diffusionsstromdichten sind wie folgt definiert:
*
j = K A − A
gasseitig:
gas g
(
g g
)
*
flüssigseitig: j = K ( A − A )
Phasengrenze
A* g
A l *
A l
Grenzschicht Grenzschicht
Gas
flüssig
* *
H ⋅ A 1
= A
g
*
max
l l l l
⎛
⎞
*
− = ⎜
1 1
+ ⎟
l,max
Al
j
⎝ K
g
⋅ H Kl
⎠
1 1
= +
L
k
g
⋅ H kl
Daraus folgt (da j gas = j fl im Gleichgewicht sein muß)
A
und j = K L (A l,max * – A l )
Für K L gilt:
und da k g » k l
1
K
↷
K
1
k l
H ⋅ A 1,
= A
g
Ort

Einführung in die Biotechnologie - 48 - Scheper, TCI Hannover
und da
Q
j = &
mit a = spez. Austauschfläche a =
a
A
V
Q&
= k ⋅a
l
*
( A − A )
l.max
l
Diese Beziehung gilt streng nur an einem bestimmten Ort.
Der Sauerstoffübergang selbst hängt seinerseits von drei Faktoren ab:
1. Stoffübergangskoeffizient K l (abhängig von der Grenzfilmdicke, Reynoldszahl)
2. Übergangsfläche
3. Konzentrationsgradient
Die Übergangsrate erreicht ihr Maximum, wenn c l = Null ist. Weit verbreitete Verfahren zur
Bestimmung der Übergangsrate (und damit sind k L a):
→ "gassing out" (c l = 0)
→ "steady-state oxygen balance" oder “dynamische Methode”
Was sollte bei der Bestimmung des Stoffübergangskoeffizienten (k l a) beachtet werden?
Optimal ist eine (k l a)-Wertbestimmung direkt während des Bioprozesses. Dies ist jedoch
kompliziert und aufwendig. In der Regel greift man daher auf ein synthetisches Medium
zurück, das dem Medium im Bioprozeß ähnelt. Da sich der O 2 -Bedarf in Abhängigkeit vom
Entwicklungsstadium des biologischen Systems ändert, ist es von besonderem Interesse,
einen Zusammenhang zwischen (k l a) und der Hydrodynamik (Reynoldszahl) festzustellen,
um maximalen Sauerstoffeintrag sicherstellen zu können: Der in der Flüssigphase gelöste
Sauerstoff sollte maximal verbraucht werden.
Das synthetische Medium sollte folgenden Ansprüche genügen:
- ähnliche Viskosität
- ähnlicher gasförmig/flüssig Phasenwiderstand
- ähnliches Koaleszenzverhalten
- ähnliche Sauerstofflöslichkeit und -diffusion
9. Grundoperationen für den Bioprozeß
→ Medienbereitstellung
→ Vorkultur
→ Luftfiltration (bei Begasung)
→ Prozeßkontrolle
→ Zellrückgewinnung
→ Sterilisation/ Sterilfiltration:
- Autoklav (Satzbetrieb)
- Dampf-Reaktor (Satzbetrieb)
- Wärmeaustauscher (kontinuierlicher Betrieb)
- Filtration (kontinuierlicher Betrieb)
10. Aufarbeitung und Isolierung von Produkten

Einführung in die Biotechnologie - 49 - Scheper, TCI Hannover
Das generelle Problem bei der biotechnologischen Herstellung chemischer Verbindungen ist
die Trennung von Biomasse und gewünschtem Produkt. Je nach Art der Anreicherung (extraoder
intrazellulär) und Aggregatzustand ergeben sich zur Aufarbeitung die folgenden
Möglichkeiten.
Abtrennung der Feststoffe:
Filtration
Zentrifugation
Sedimentation
Flotation (bei extrazellulärer Anreicherung)
Isolierung (1. Schritt) Aufkonzentrierung, Capture-Schritt
Extraktion (wäßrig-wäßrig; wäßrig-organisch)
Sorption
Präzipitation
Ultrafiltration
Isolierung (2. Schritt) Reinigung, Polishing
fraktionierte Präzipitation
Chromatographieschritte
Adsorption
Produktisolierung, Formulierung:
Überführung in Handelsform (gebräuchlich sind: Marumerizer (überzogene Enzyme),
Prils (eingebettete Enzyme); als Matrix dienen Fettalkoholetylenoxidprodukte
oder PEG (Smp. bei 50- 70°C))
Zentrifugationstrocknung von Kristallen
Sprühtrocknung
Lyophilisierung
Frage: Wieviele Aufreinigungsschritte sind notwendig und ökonomisch vertretbar
(Aufwand-Kosten-Effekt). Diese Abschätzung ist bei jedem Schritt notwendig.
Reinigungseffekt
gering
mäßig
hoch
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Aufreinigungsschritt

Einführung in die Biotechnologie - 50 - Scheper, TCI Hannover
Flow Chart for Monoclonal Antibody Production
Master
Cell
Bank
T-Flask
12L 100L 500L 2,000L
Viral
Filtration
Viral
Inactivation
Anion/Cation Ex.
Chromatography
Protein A
Chromatography
Filtration
10,000L
(1gm/L)
Ultra
Filtration
Frozen Bulk
(65% Yield) Finished Product!
Sources: The Biopharm Guide to Fermentation and Cell Culture and industry sources.
Abbildung Aufreinigungsschema für monoklonale Antikörper
rt-PA-Aufreinigung
Kultivierung Capture Polishing
Pharmazeutische
Formulierung
ca. 10.000 l batches
mit ca. 1-5 kg
Zielprotein
Aufarbeitung
ca 40-50% der Gesamtkosten

Einführung in die Biotechnologie - 51 - Scheper, TCI Hannover
Aufreinigungsschema für ein Antitrombolytikum
Aufreinigungsverfahren bei der rt-PA-Gewinnung
Fermentation
Lysin-
Affinitäts-
Schritt
Kationenaustauschschritt
ca. 10.000 l batches
mit ca. 1-5 kg
Zielprotein
Ultrafiltration
Ultrafiltration
Virusentfernung
Reinheit
über 99%
Galenik
Gelpermeationschromatographie
pharmazeutische
Formulierung
Ultrafiltration
Virusfilter
(ins. 20 log-
Schritte)
Anionenaustauschschritt
DNA-Entfernung
Aufarbeitung ca 40-50% der Gesamtkosten
Detaillierteres Aufarbeitungsschema für ein Antitrombolytikum
Fermentationsbrühen sind komplexe Mischungen aus einer Vielzahl von Substanzen in
verdünnten Lösungen. Die Aufarbeitung beschäftigt sich damit, das Zielprodukt in höchst
reiner Form aus dieser komplexen Mischung zu isolieren. Dazu ist eine Vielzahl von
Aufarbeitungsschritten nötig, indem das Tierprodukt aufgereinigt und die Störkomponenten
abgereichert werden. Die Aufarbeitungskosten nehmen oftmals einen erheblichen Teil der
Erstellungskosten ein. So kann man davon ausgehen, dass bei der Antibiotikaproduktion die
Fermentationskosten im Verhältnis zu den Aufarbeitungskosten von etwa 60 : 40 liegen
(beispielsweise Penicillin). Bei rekombinanten Proteinen und monoklonalen Antikörpern
liegen die Aufarbeitungskosten im Bereich von 80 – 90 % der Prozesskosten. Dabei ist zu
bedenken, dass die Produktkonzentration im Bereich von 0,1 – 5 g/l in der
Fermentationsbrühe liegen und neben der reinen Aufkonzentrierung auch die Abreicherung
der Störkomponenten beachtet werden muss.
10.1. Filtration
Bei der Filtration wird das Fermentationsmedium durch ein Filtermaterial geleitet, durch das
großmolekulare Substanzen zurückgehalten werden. Die Porengröße der Filtermaterialien
bestimmt die Ausschlussgrenzen (Filtration, Mikrofiltration, Ultrafiltration etc.). Die
Filtration im statischen Betrieb (Dead-end-Filtration) oder dynamischen (Crossflow-
Filtration) durchgeführt werden. Für kontinuierliche Filtrationsvorgänge bieten sich
Crossflow- bzw. Tangentialflow-Filtereinheiten an (Grundlagen der Filtrationstheorie siehe
Vorlesung Unit Operations).

Einführung in die Biotechnologie - 52 - Scheper, TCI Hannover
10.2. Zentrifugation
Bei der Zentrifugation wird eine Trennung von Feststoffbestandteilen über Zentrifugalkräfte
erreicht. Diese Zentrifugationen können auch im kontinuierlichen System durchgeführt
werden. Verschiedenste Systeme stehen zur Verfügung. Auch die Trennung von gelösten
Substanzen ist in der Ultrazentrifugation, beispielsweise in Saccharosegradienten möglich.
10.3. Zellaufschluss
Neben der Zellabtrennung durch Zentrifugation und Filtration kann dazu dienen, die Zellen
selbst vom produkthaltigen Medium zu trennen. Es kann aber auch nötig sein, die Zellen
aufzuschließen, um das darin enthaltene Produkt für die Aufarbeitung zugänglich zu machen.
Verschiedene Systeme sind bekannt, um die Zellen mit Hilfe eines Energieeintrags
aufzuschließen. So kann durch den Eintrag mechanischer Energie (z. B. Kugelmühlen,
Hochdruckpumpen, Homogenisatoren, Ultraschall) ein Zellaufschluss erreicht werden. Diese
Methoden arbeiten kontinuierlich, tragen aber die Gefahr, dass das Produkt durch den
mechanischen Stress (auch Wärmeentwicklung) zerstört wird. Nicht mechanische Methoden
umfassen den enzymatischen Verdau/Andau, den Ansatz von Lösungsmitteln und
Detergentien, die die Zellwände/Membranen zerstören, oder mit osmotischen Schock- oder
Einfrierzyklen. Im Allgemeinen werden Kugelmühlen oder Hochdruckhomogenisatoren
(gekühlte Systeme) für den kontinuierlichen Aufschluss von verschiedensten Zellen
verwendet.
10.4. Captureschritt
Nach der Zellisolierung und dem Zellaufschluss werden im Allgemeinen einfache Schritte zur
groben Produktisolation verwendet. Die Auswahl der Verfahren hängt dabei stark von den zu
isolierenden Produkten ab (z.B. Fällung, Hitzedenaturierung von Fremdproteinen).
10.5. Chromatographie
Chromatographische Methoden werden auf vielfältige Weise eingesetzt. Sie basieren darauf,
dass selektive Adsorptionsschritte auf den Festkörpern dazu führen, dass in dem
kontinuierlich fließenden Medium eine Aufteilung der Inhaltsstoffe erfolgt, da die einzelnen
Inhaltsstoffe eine unterschiedliche Affinität zur Oberfläche des Trenngels haben. Im
Allgemeinen werden folgende Chromatographiemethoden verwendet
1) Adsorptionschromatographie
2) Verteilungschromatographie
3) Ionenaustauschchromatographie
4) Gelchromatographie
5) Affinitätschromatographie.
Zu 1.) Abhängig von den Adsorptionseigenschaften der zu trennenden Substanzen auf der
festen Phase des Chromatographieprozesses (Holzkohle, Silikate, Aluminiumoxide,
Hydroxyapatite, synth. Polymere).
Zu 2.) Hier werden die zu trennenden Substanzen zwischen 2 Phasen verteilt. Dabei hat die
feste Phase die Aufgabe eine Phase festzuhalten. So kann eine hydrophile stationäre Phase
eine wässrige Phase festhalten. Die mobile Phase wird dann eine organische Phase sein.
Die Auftrennung bei der Verteilungschromatographie ist vom Verteilungskoeffizienten
abhängig. Dieser beschreibt das Verteilungsgleichgewicht der zu trennenden Komponenten
zwischen der stationären Phase und der mobilen Phase. Die Temperatur spielt eine wichtige
Rolle. Die Auftrennung erfolgt langsam, da sich jeweils ein Gleichgewicht einstellen muss.
Hier versteht man unter „Reversed phase chromatography“ eine stationäre organische Phase
auf einem hydrophoben stationären Material und eine wässrige Phase als mobile Phase.

Einführung in die Biotechnologie - 53 - Scheper, TCI Hannover
Zu 3.) Ionenaustauschchromatographie
Hier werden die zu trennenden Substanzen durch reversible Ionenbindungen (Ladungseffekte)
auf der festen Phase gebunden. Die meisten Ionenaustauscher sind auf der Basis synthetischer
Polymere vorhanden oder es handelt sich um modifizierte Dextrane und
Zellulosenmaterialien. Über Salzgradienten oder pH-Gradienten können die gebundenen
Substanzen eluiert werden.
Zu 4.) Bei diesem Verfahren wandern Moleküle in einer Säule durch ein poröses Material und
werden aufgrund eines "Siebeffektes" separiert. Daraus leiten sich auch die verschiedenen
Namen dieser Technik ab: Die Größenausschluß-Chromatographie (size exclusion
chromatography, SEC) wird im Fall von wäßrigen Trennsystemen auch Gel-Filtrations-
Chromatographie (GFC) und bei nichtwäßrigen Systemen auch Gel-Permeations-
Chromatographie (GPC) genannt.
Gel-Chromatographie (SEC)
wäßrige Systeme: GFC
nichtwäßrige Systeme: GPC
Generell wird in der Gel-Chromatographie zwischen fünf Arten von Materialien unterschieden:
Quervernetzte Dextrane, Agarose, Polyacrylamid, Polyacryloylmorpholin und Polystyrole.
Drei Arten finden jedoch nur breitere Anwendung: Agarose (z. B. Bio-Gel A,
Sepharose), Dextrane (z. B. Sephadex, Sephacryl) und Polyacrylamide (z. B. Bio-Gel P,
Toyopearl).
Die wichtigsten Faktoren in der Gel-Chromatographie sind die Bett-Geometrie und die
Flußrate. Für ersteres spielen nicht nur die Betthöhe und der Bettdurchmesser eine Rolle,
sondern auch verschiedene Volumina: Das Gesamtbettvolumen V t
(oder auch BV) wird wie
ein Zylinder aus Höhe und Durchmesser des Gelbettes berechnet (V = hπr 2 ).
Das Hohlraumvolumen, auch interstitieller Raum oder Totvolumen genannt, V 0
beschreibt das
Volumen der flüssigen Phase zwischen den Gelkörnern. Dieses Volumen wird mit Hilfe einer
Substanz, die nicht vom Gelbett retardiert wird, über die Messung des Elutionsvolumens
bestimmt. In der Gel-Chromatographie wird häufig Dextran blue mit einer Molekülmasse von
über 2 Millionen Da verwendet. In Abbildung 2.5 sind die verschiedenen Variablen zur Beschreibung
eines Gelbettes noch einmal veranschaulicht.
V 0
V x
V t
Abb. 10.1: Variablen zur Bestimmung des chromatographischen Betts .

Einführung in die Biotechnologie - 54 - Scheper, TCI Hannover
Abbildung 2.6 zeigt schematisch eine Trennung von Molekülen mittels SEC und dem daraus
resultierenden Chromatogramm.
Probenaufgabe
Größenauftrennung
gr. Moleküle
eluieren
kl. Moleküle
eluieren
Chromatogramm
Injektion
t 1 t 2
Retentionszeit
Abb. 10.2: Schematische Darstellung der Trennung von Probenmolekülen bei der Gel-Chromatographie
mit resultierendem Chromatogramm .
Für den Trennmechanismus bei der Gel-Chromatographie wurden zahlreiche Modelle entwickelt.
Dabei spielen die Trennung durch den Fluß, geometrische Überlegungen, begrenzte
Diffusion und thermodynamische Überlegungen eine Rolle.
Modell 1:
Abb. 10.3: Geometrische Modelle der Gel-Chromatographie: konische Porenöffnung (links),
zylindrische Porenöffnung (rechts) .
Modell 2:

Signal
Einführung in die Biotechnologie - 55 - Scheper, TCI Hannover
∆S « 0
K SEC
→ 0
V R
= V 0
∆S < 0
K SEC
= 0,5
V R
< V t
∆S = 0
K SEC
= 1
V R
= V t
Abb. 10.4: Thermodynamisches Modell der Gel-Chromatographie: Elution verschieden großer
Moleküle.
Zu 5 Affinitätschromatographie
Bei der Affinitätschromatographie werden biospezifische Rezeptoren verwendet, die mit den
komplementären Liganden (Proteine, Zellen etc.) eine hoch selektive Verbindung eingehen.
Der Rezeptor wird dabei meistens kovalent gebunden. Die Bindung zwischen Rezeptor und
Ligand (häufig auch Effektor und komplementäres Molekül) genannt, hängt von den
Affinitätskonstanten ab. Die Bindung wird meist über einen kokurrierenden Liganden eluiert.
10.7. Mathematische Beschreibung der Chromatographie
t 0
t 1
t 2
h 1
h 2
Zeit
w 1
w 2
Abb. 10.5: Schematische Darstellung eines Chromatogramms mit den wichtigsten Kenngrößen.
Die Abkürzungen bedeuten:
t 0
Totzeit benötigte Zeit von der Injektion bis zur
Detektion für eine nicht retardierte Substanz
t 1
/ t 2
Retentionszeit für
Substanz 1 bzw. 2 Zeit bis zur Detektion einer retardierten Substanz
h 1
/ h 2
Peakhöhe für
Substanz 1 bzw. 2 Abstand vom Peak-Maximum bis zur Basislinie

Einführung in die Biotechnologie - 56 - Scheper, TCI Hannover
w 1
/ w 2
Peakbreite für
Substanz 1 bzw. 2
an der Basislinie gemessen
Als ideale Verteilung von Meßwerten bei chromatographischen Prozessen wird die Normalverteilung
nach Gauß angenommen. Die Gleichung für die Gaußsche Glockenkurve lautet
[26]:
2
( t −µ
) ⎤
⎥⎦
1 ⎡ 1
f (t) = exp ⎢-
2
σ 2 π ⎣ 2 σ
(Gl. 2.4)
mit: µ: Mittelwert
σ: Standardabweichung
An der Stelle des Mittelwertes befindet sich das Kurvenmaximum, die Wendepunkte liegen
jeweils eine Standardabweichung vom Mittelwert entfernt. Je größer die
Standardabweichung, desto flacher ist die Kurve.

Einführung in die Biotechnologie - 57 - Scheper, TCI Hannover
11. Bioprozessanalytik
Grundvoraussetzung für die Entwicklung eines optimalen Bioprozesses sind:
a) Verfügbarkeit geeigneter Analysensysteme
b) Verarbeitung der anfallenden Messdaten
c) Prozessmodellierung und –regelung.
Die Abbildung 11.1 zeigt schematisch, wie diese Schritte bei der Bioprozessentwicklung und
–führung ineinander greifen.
Modellierung
und
Regelung
Beobachtung der
physikalischen Umgebung
Bioprozeß
Beobachtung der
chemischen Umgebung
Datenerfassung
und
Auswertung
Beobachtung des
biologischen Systems
(Zellzustand)
Abbildung 11.1
Analytik
Die genaue Analyse des Bioprozesses bildet dabei die erste Stufe. Die hier gewonnenen
Daten werden im nächsten Schritt erfasst und ausgewertet. Dabei ist es nötig, die einzelnen
Messgrößen nicht nur eigenständig zu verwenden, sondern auch untereinander zu
vergleichen, um ihre Aussagekraft und Genauigkeit zu erhöhen. Es ist das Ziel der
Datenerfassung und –auswertung, sichere und zulässige Daten für die Modellierung und
Regelung zur Verfügung zu stellen. An Hand der Modellierung kann der Bioprozess optimiert
oder unter den günstigsten Bedingungen betrieben werden. Dazu ist eine geeignete Regelung
nötig. Sie erfolgt über die Veränderung einzelner Prozessparameter.
Die Analyse biotechnologischer Prozesse soll schnell, zuverlässig und spezifisch erfolgen und
die Beobachtung des biologischen Systems selbst und seiner chemischen und physikalischen
Umgebung gewährleisten. On-line- und In-situ-Arbeitenanalysesysteme ermöglichen die
direkteste und schnellste Prozessbeobachtung. Daneben sind automatisierbare Systeme, die
eine kontinuierliche, repräsentative Probe analysieren, zu bevorzugen. Off-line-Analysen
liefert meist erst nach langer Analysenzeit und mit hohem Personalaufwand Ergebnisse und
können somit erst mit einer Zeitverzögerung den Reaktorzustand widerspiegeln.

Einführung in die Biotechnologie - 58 - Scheper, TCI Hannover
Bei der Analyse der chemischen und physikalischen Größen kann man unterscheiden
zwischen der Bestimmung lokaler Größen (z. B. der Temperatur an einem bestimmten Punkt)
und globaler Größen (z. B. der Wärmeentwicklung im Gesamtreaktor). Die Bestimmung des
Zellzustands lässt sich dazu noch weiter unterteilen. So kann man alle von dem Sensor
erfassten Zellen integral oder über jede einzelne Zelle segregiert messen. Die Erfassung
einzelner Zellen in einer Zellpopulation ist speziell für die detaillierte Beschreibung von
Reaktionsprozessen interessant.
Die Medienzusammensetzung und der Zellzustand sind eng miteinander verknüpft.
Stoffwechselprodukte der Zellen reichern sich im Medium an, Substrate werden verbraucht.
Indirekt lassen sich aus den Daten der Medienzusammensetzung auch Aussagen über den
Zellzustand machen. Manche Zellprodukte werden aber intrazellulär angereichert und
entziehen sich so der Analyse des Mediums. Auch sind Verfahren, die den Zellzustand direkt
beschreiben, den indirekten und zum zeitverzögerten vorzuziehen.
Die Tabelle 11.1 zeigt verschiedene Messgrößen, die an einem Bioprozess gemessen werden
können und in Abbildung 11.2 ist exemplarisch eine Vielzahl von Messgrößen und
Messverfahren aufgeführt.
Die Analyse der Medienzusammensetzung – und hier speziell der Edukte und Produkte –
kann mit selektiv arbeitenden Biosensoren erfolgen.
Größe
Sensor
Temperatur
Druck
Rührerdrehzahl, -energieeintrag
Schaumentwicklung
Flußrate
Flüssigkeitslevel
Viskosität
Trübung
Thermometer, Thermistor
Druckaufnehmer
Drehzahlmesser/ Wattmeter
Leitfähigkeitssensor
Rotameter, thermische Messeinheiten, Doppler
Leitfähigkeit, Ultraschall
Viskosimeter
Fotometer
Tabelle 11.1
Durch die Kopplung einer biologischen Detektionskomponente an einen Sensor
(Signalwandler, Transducer) erhält man einen Biosensor. Der prinzipielle Aufbau von
Biosensoren ist in Abb. 11.3 zu sehen. Die biologische Komponente hat die Aufgabe, mit der
zu analysierenden Substanz spezifisch und sensitiv zu reagieren. Die dabei auftretenden
Änderungen werden vom Sensor erfasst und in ein biologische Signal umgewandelt, verstärkt
und verarbeitet. Die biologische Komponente kann aus Enzymen, Mikroorganismen,
Organellen, Zellverbänden, Antikörpern, Lektinen oder Oligonukleotiden bestehen.
Prinzipiell kann jede biologische Komponente verwendet werden, die mit der zu
analysierenden Substanz eine von geeigneten Sensoren erfassbare spezifische Reaktion
eingeht. Die biologische Komponente ist als Signalgeber zu bezeichnen. Mögliche

Einführung in die Biotechnologie - 59 - Scheper, TCI Hannover
Komponenten und Transducer sind in Tabelle 11.2 aufgelistet, der man die Vielzahl von
Kombinationsmöglichkeiten entnehmen kann.
Biosensoren sind nicht sterilisierbar und können deshalb nicht in einen Bioprozess direkt
eingebracht werden. Normalerweise wird eine Probe entnommen und außerhalb des Reaktors
mit den Biosensoren vermessen. Dies geschieht im allgemeinen über
Fließinjektionsanalysesysteme (Bio 4, siehe Abb. 4).
Physikalische Zellumgebung
Chemische Zellumgebung
Drehzahl
-Drehzahlmesser
Energieeintrag
-Drehmoment
pH-Wert
- pH-Glaselektrode
Redoxverhalten
- Redoxelektrode
Strömungsgeschwindigkeit des Fluids
- Wärmepulsmethode
Strömungsgeschwindigkeit der Gasphase
- Ultraschall-Doppler-Verfahren
Viskosität
-Viskosimeter
Druck
- Membransensoren
Schaumerkennung
- Widerstandsmessung
Temperatur
- Thermometer, Thermistoren,
Thermoelemente
Fluidzufuhr
- Tropfenzähler
- Waage
- Massflowmeter
Gaszufuhr
-Massflowmeter
sterilisierbare Biosensoren
- z.B. Penicillinsensor
Biomassebestimmung
- opt. Sensoren, Filtrationssonde
Gelöstgasgehalt
- amperometrischer Sauerstoffsensor,
CO -Elektrode
2
flüchtige Substanzen
- Massenspektrometer
Gasphase
- paramagnetisch (z.B. O
2)
- IR (z.B. CO )
2
Ablauf, Überlauf
zellfreie Proben zur Analyse
der Mediumbestandteile
zellhaltige Probe zur:
- Off-line-Bestimmung von Zellkomponenten
- automatischen Bestimmung von Zellkomponenten
- Probenahme
Analyse der Probe im Bypass
-opt. Sensoren (NADH)
On-line- und in-situ-Analyse
der Mikroorganismen
- opt. Sensoren
- NMR, Kalorimetrie
Biologische Zellumgebung
Abbildung 11.2

Einführung in die Biotechnologie - 60 - Scheper, TCI Hannover
bio. Komponente Transducer Verstärker Datenverarbeitung
Substrat
Produkt
z. B. Wärme
Elektronen
Protonen
Licht
+
Ionen (z.B. NH 4 )
Gase (z.B. O 2)
Fluoreszenz
Masseänderung
Abbildung 11.3
Computerkontrolle
Computer
Datenübertragung
Pumpe
Injektionsventil
immobilisierte Enzyme
Sensor
Entsorgung
Trägerpuffer
Entsorgung
Fermenter
Filtrationssonde
Signale
Abbildung 11.4
Sauerstoffmessung
Das wichtigste System zur Messung der Sauerstoffkonzentration in Fermentationsmedien ist
die amperometrische Sauerstoffbestimmung (z.B. Clark-Elektrode).

Einführung in die Biotechnologie - 61 - Scheper, TCI Hannover
Wichtig ist, daß diese Sensoren den Partialdruck messen, da eine sauerstoffpermeable
Membran verwendet wird. (vgl. Abb.)
Auf molekularerer Ebene laufen an den Elektroden folgende Vorgänge ab.
1
−
Kathode:
2
O2 H2O 2e Pt
−
+ + ⎯→
2OH
−
−
Anode: Ag + Cl ⎯ → AgCl + e
Bei der amperometrischen Elektrode ist eine konstante Spannung an den Elektroden angelegt.
Der resultierende Strom, der von der Sauerstoffkonzentration abhängt, wird an der Kathode
gemessen

Einführung in die Biotechnologie - 62 - Scheper, TCI Hannover
12. Enzymkinetik
In diesem Kapitel wird gezeigt, wie biotechnologische Prozesse mit Hilfe von Enzymen
durchgeführt werden können. Dazu werden diese Biokatalysatoren zuerst allgemein
beschrieben, um darauf aufbauend reaktionstechnische Aspekte näher zu erörtern. Es folgen
Experimente, die Möglichkeiten und Eigenarten der Enzymprozeßtechnik aufgezeigen.
12.1 Allgemeines
Enzyme sind die katalytisch aktiven Einheiten in lebenden Organismen. Sie haben die
Aufgabe, Stoffwechselreaktionen effektiv und unter optimalen energetischen Bedingungen
durchzuführen. Sie zeichnen sich durch eine hohe Reaktions- und Substratspezifität aus und
erlauben es, die katalysierten Stoffwechselreaktionen unter milden physiologischen
Bedingungen in etwa 10 6 - bis 10 12 mal schneller durchzuführen als die nichtkatalysierten
Reaktionen. Die katalytische Aktivität kann durch verschiedene Mechanismen reguliert
werden.
Enzyme sind Proteine. Seit einigen Jahren sind aber auch katalytisch aktive RNA-
Einheiten bekannt. Sie werden in diesem Buch nicht näher behandelt. Neben dem
eigentlichen Proteinanteil können auch noch Cofaktoren für das funktionsfähige Enzym nötig
sein. Hierzu zählen Metallionen (z.B. Zn 2+ in der Carboanhydrase oder Fe 2+ /Fe 3+ in der
Katalase) oder kleinere organische Moleküle wie das NAD(P)H (reduziertes Nicotinamidadenin-dinucleotid-(phosphat)).
Letztere heißen Coenzyme. Sind sie (z.B. das Flavin-adenindinucleotid,
FAD + ) kovalent an das Enzym gebunden, werden sie als prosthetische Gruppen
bezeichnet. Coenzyme gehen verändert aus der enzymatischen Reaktion hervor. Sie sind als
Cosubstrat anzusehen und müssen vor einem erneuten Einsatz regeneriert werden.
Man kann grob sechs Gruppen von Enzymen unterscheiden, die wiederum in
verschiedenen Untergruppen aufgeteilt sind:
1. Oxidoreduktasen (katalysieren Redoxreaktionen)
2. Transferasen (katalysieren die Übertragung verschiedener Gruppen)
3. Hydrolasen (katalysieren hydrolytische Reaktionen)
4. Lyasen (katalysieren nicht-hydrolytische Abspaltungsreaktionen)
5. Isomerasen (katalysieren Isomerisierungsreaktionen)
6. Ligasen (katalysieren Verknüpfungsreaktionen)
Die meist vierstellige E.C.-(Enzyme commission) Nummer eines Enzyms gibt an, zu
welcher Haupt- und Untergruppe ein Enzym gehört. Aus der E.C.-Nummer des Enzyms läßt
sich also der Reaktionstyp herleiten, der es katalysiert. Als Beispiel sei die Glucoseoxidase
(E.C. 1.1.3.4) angeführt, die die Oxidation von -Glucose zum Gluconolacton katalysiert.
Die erste Ziffer (1) besagt, daß es sich um eine Oxidoreduktase handelt, die zweite Ziffer (1),
daß das Enzym auf eine Hydroxygruppe wirkt, die dritte Ziffer (3), daß Sauerstoff der
Elektronenakzeptor ist und die vierte Ziffer (4) ist eine laufende Nummerierung in dieser
Unter-Unter-Klasse.
Eine der Voraussetzungen für die katalytische Aktivität ist die korrekte Konformation
der Proteine. Nur mit ihr ist es möglich, daß das sogenannte aktive Zentrum des Enzyms mit
dem umzusetzenden Substrat so wechselwirkt, daß ein Enzym-Substrat-Komplex gebildet
wird. Hier kann man entweder annehmen, daß Enzym und Substrat wie Schlüssel und Schloß
von vornherein zueinander passen oder daß dieser Komplex über einen „induced fit“ gebildet
wird. Dabei paßt sich das Enzym (speziell das aktive Zentrum) der Substratstruktur an. Ein
Enzym-Substrat-Komplex bildet sich, der einen erleichterten Zugang zu dem
Übergangszustand zwischen Substrat und Produkt ermöglicht. Der Komplex reagiert dann zu

Einführung in die Biotechnologie - 63 - Scheper, TCI Hannover
den Produkten ab. Die gesamte Reaktion wird beschleunigt, da die freie Aktivierungsenergie
zur Bildung dieses Übergangszustands zwischen Substrat und Produkt im Enzym-Substrat-
Komplex deutlich geringer ist als bei der nichtkatalysierten Reaktion. Die maßgeblichen
nichtkovalenten Kräfte zur Ausbildung der Konformation eines Proteins sind die gleichen, die
zur Bildung des Enzym-Substrat-Komplexes führen: van-der-Waals-Kräfte, hydrophobe und
elektrostatische Wechselwirkungen und Wasserstoffbrückenbindungen.
Enzyme sind in den von ihnen katalysierten Reaktionen fast ausschließlich
stereospezifisch. Im allgemeinen wird also nur ein Enantiomer umgesetzt oder gebildet. Dies
gilt auch für prochirale Verbindungen. Gegenüber der Substratstruktur sind Enzyme
unterschiedlich selektiv. Diese auch als geometrische Spezifität bezeichnete Eigenschaft, läßt
sich gut an den unterschiedlichen Proteasen zeigen. Die Protease Subtilisin spaltet beliebige
Peptidbindungen, während Trypsin hochspezifisch nur Arginin-Glycinbindungen spaltet.
Auch die Spezifität für die Art der katalysierten Reaktion (Wirkungsspezifität) kann
unterschiedlich sein. Während Trypsin nur Peptidbindungen spaltet, können Chymotrypsine
Peptid- und Esterbindungen hydrolysieren.
12.2. Herstellung
Enzyme werden aus den Zellen isoliert, die sie in ausreichender Menge produzieren. Das
können natürliche, u.a. auch Hefe, Bakterien oder durch Mutation bzw. Gentechnik optimierte
Produzenten (Hefe, Bakterien) sein. Zur Aufarbeitung extra- und intrazellulärer Enzyme
werden die zur Proteinreinigung bekannten Methoden verwendet (z.B. Zentrifugation,
Ultrafiltration, Chromatographie). Generell kann man sagen, daß der Preis eines Enzyms
direkt proportional mit der Reinheit und umgekehrt proportional zur Konzentration im
Produzenten steigt.
12.3. Einsatz
Für Enzyme gibt es die viele Einsatzmöglichkeiten: Als Therapeutikum können sie in der
Medizin beispielsweise bei der Behandlung von Thrombosen (Urokinase) oder von
Verdauungsstörungen (Lipasen, Proteasen) eingesetzt werden. Vielfältig ist der Einsatz in der
Analytik. Hier sind besonders die Medizin, die Lebensmitteltechnik und die biochemische
Analytik zu erwähnen (siehe auch Kapitel Biosensoren). Für all diese Einsatzzwecke werden
Enzyme mit hoher Reinheit verwendet. Der Mengenbedarf ist relativ klein.
Bei den industriell in großen Mengen genutzten Enzymen werden nicht so hohe
Reinheitsansprüche gestellt. Zu diesen Enzymen, die meist als technische Produkte verwendet
werden, gehören Proteasen (Waschmittelzusätze, Ledergerberei), Amylasen und Glucose-
Isomerase (Stärkeverzuckerung, Lebensmittelverarbeitung), Pektinasen (Fruchtsaftzubereitung),
Lipasen (Waschmittelzusätze, Fettverarbeitung), Glucoseoxidase/Katalase (Lebensmittelzusätze
zur Sauerstoffentfernung).
Bei den teureren Enzymen bietet sich bei der technischen Verwendung eine
Immobilisierung an (siehe unten). Immobilisierte Enzyme werden bei der Herstellung von 6-
Aminopenicillansäure aus Penicillin, bei der Gewinnung von L-Aminosäuren aus N-Acetyl-
D,L-Aminosäuregemischen oder der Produktion von Fructose aus Glucose eingesetzt.

Einführung in die Biotechnologie - 64 - Scheper, TCI Hannover
12.4. Enzymkinetik
Für den industriellen Einsatz ist die Kinetik der freien (nativen) und immobilisierten Enzyme
von Interesse. Jedes Enzym hat eine andere spezifische Aktivität, mit der es bestimmte
Substrate umsetzt. Diese Aktivität kann auf verschiedene Art und Weise beeinflußt werden.
Am einfachsten kann die Gesamtaktivität in einem Reaktionsprozeß über die Menge an
Enyzm geregelt werden. Technisch interessant ist auch die Regelung der Aktivität über die
Temperatur und den pH-Wert. Mit steigender Temperatur durchläuft die Enzymaktivität ein
Maximum, wobei oftmals die Enantioselektivität abnimmt. Dieses Maximum entsteht, da
zuerst die Aktivität mit der Temperatur zunimmt, die Proteindenaturierung ab einer kritischen
Temperatur aber so stark ist, daß die Aktivität ingesamt drastisch abnimmt. Ein ähnliches
Optimum existiert auch bei der pH-Abhängigkeit. Auch dies ist verständlich, wenn man den
Einfluß des pH-Werts auf die Proteinkonformation bedenkt (Protonierung/Deprotonierung
verschiedenster Gruppen). Aus der Biochemie ist bekannt, daß Enzyme auch durch
allosterische Effekte (Hemmung bzw. Aktivierung durch Anlagerung an ein regulatorisches
Zentrum), durch proteolytische Aktivierung (Spaltung einer inaktiven Vorstufe zum aktiven
Enzym) und durch reversible kovalente Modifikation (z.B. Phosphorylierung von
Seringruppen) in ihrer Aktivität gesteuert werden können.
Bei enzymatischen Reaktionen spricht man bei der Reaktionsgeschwindigkeit von
Enzymaktivität. Dies ist eine extensive Größe, da eine größere Enzymmenge auch eine
höhere Reaktionsgeschwindigkeit bedeutet. Die häufigste Einheit der Enzymaktivität ist die
internationale Einheit U (international unit). Das ist die Enzymmenge, mit der bei 25 o C unter
optimalen Bedingungen 1,0 mol des Substrats pro Minute umgesetzt wird. Man
unterscheidet Aktivität (U), Volumenaktivität (U/ml), molare Aktivität (U/mol) und
spezifische Aktivität (U/mg). Die spezifische Aktivität, bei der sich die Aktivität auf die
Menge Enzym bezieht, gibt die Reinheit des Enzyms an. Die neuere internationale Einheit ist
das Katal (kat). Es ist die Aktivität, die bei optimalen Bedingungen ein Mol des Substrats pro
Sekunde umsetzt. Damit gilt 1 U = 16,67 nkat oder 1 kat = 60 U.
Im folgenden soll die Kinetik enzymatischer Reaktionen näher behandelt werden. Das
Michaelis-Menten-Modell beschreibt die kinetischen Eigenschaften von Enzymen am
einfachsten. Voraussetzung ist, daß das Enzym mit dem Substrat einen Enzym-Substrat-
Komplex bildet, der dann in das Produkt und das Enzym abreagiert. Dabei dissoziert das
Produkt sofort ab. Dieser Zerfallsschritt ist geschwindigkeitsbestimmend. Eine Rückreaktion
des Enzyms mit dem Substrat ist nicht möglich. Das gilt dann, wenn die Reaktion irreversibel
ist oder am Beginn einer Reaktion, wenn noch kein oder sehr wenig Produkt vorliegt.
Die Reaktionsgleichung hierfür lautet:
E + S
k 1
ES
k 2
E + P
k -1
Es kommt zur Ausbildung eines stationären Zustandes, in welchem nach einer
Anlaufphase die Konzentration an Enzym-Substrat-Komplex konstant bleibt
(Fließgleichgewicht, steady state). Für die Reaktion läßt sich das Geschwindigkeitsgesetz wie
folgt aufstellen:
d[ES]
dt
= k 1 ([ E] [ ES]
)[ ] ( ES) [ ES]
0
− S −k−1 −k 2
, (x.1)
wobei [ E] = [ E] −[ ES]
0
die Konzentration an freiem Enzym ist.

Einführung in die Biotechnologie - 65 - Scheper, TCI Hannover
⎛
Für den „Steady state“ gilt: dES [ ] ⎞
⎜ ⎟
⎝ dt
⎠
übergeht in:
st
= 0, so daß das Geschwindigkeitsgesetz
k ([ ] [ ] )[ ] k [ ] k [ ]
1
E
0
− ES
st
S =
− 1
ES
st
+
2
ES
st . (x.2)
Durch Umformen erhält man die Michaelis-Menten-Beziehung:
( )
[ S] ⋅ [ E] −[ ES]
[ ES]
0 st −1 2
st
=
k
+ k
k
1
=
K .
M
(x3)
K M ist die Michaelis-Menten-Konstante. Führt man in diese Beziehung noch das
Geschwindigkeitsgesetz der Produktbildung
dP [ ]
v = = k ⋅[ ES]
dt
2 st
(x.4)
so erhält man einen Zusammenhang zwischen der Reaktionsgeschwindigkeit v und der
Substratkonzentration [S]:
[ S] ⋅ [ E]
0
v = k2
K + [ S]
M
(x.5)
Es lassen sich zwei Grenzfälle betrachten:
(1) [S] > K M : Bei sehr großen Substratkonzentrationen kann K M gegenüber [S] vernachlässigt
werden (Sättigung, alle aktiven Zentren besetzt). Das Geschwindigkeitsgesetz
geht über in
v= v max = k 2 [E] 0 (Reaktion nullter Ordnung) (x.6)
Im zweiten Grenzfall ist die Geschwindigkeit ist nur noch von der
Ausgangskonzentration des Enzyms und der Geschwindigkeitskonstante der Dissoziation
abhängig.
Die Beziehung (x.6) kann in die Gleichung (x.5) eingebracht werden:
M
[ S]
v = vmax
⋅
[ S]
+ K
M
(x.7)
Hierbei ist v die aktuelle Reaktionsgeschwindigkeit der enzymatischen Reaktion, v max die
maximale Reaktionsgeschwindigkeit und [S] die Substratkonzentration. Entspricht die
aktuelle Substratkonzentration der Michaelis-Menten-Konstante K M , läuft die enzymatische

Einführung in die Biotechnologie - 66 - Scheper, TCI Hannover
Reaktion mit halber maximaler Reaktionsgeschwindigkeit ab. Die maximale
Reaktionsgeschwindigkeit v max wird erreicht, wenn alle aktiven Zentren ständig mit Substrat
abgesättigt sind. Da der Zerfall des Enzym-Substrat-Komplexes geschwindigkeitsbestimmend
ist, wird dann die maximal mögliche Geschwindigkeit erreicht, wenn die die maximale
Konzentration dieses Komplexes erreicht ist.
Die kinetischen Daten v max und K M sind für jeden enzymatischen Prozeß typische
Reaktionsgrößen und damit für die reaktionstechnische Beschreibung der Reaktionen wichtig.
Um sie für eine Reaktion zu erhalten, mißt man den Umsatz bei konstanter Enzymmenge in
Abhängigkeit der Substratkonzentration. Dabei werden meist die Anfangsgeschwindigkeiten
bestimmt, um Produktinhibierungen zu vermeiden. Aus diesen Daten erhält man eine
Michaelis-Menten- Auftragung aus der man prinzipiell v max und K M ableiten kann. Die
Bestimmung
des
v
v max
1
2 v max
K M
[S]
Abbildung 12.1 Verlauf der Reaktionsgeschwindigkeit in Abhängigkeit der Substratkonzentration
gemäß der Michaelis-Menten-Kinetik (1. Ordnung, nullter Ordnung)
wahren v max - und damit auch des K M -Werts ist aber problematisch. Deshalb wird die
linearisierte Lineweaver-Burk-Auftragung vorgezogen, bei der die reziproken
Substratkonzentrationen gegen die reziproken Geschwindigkeiten augetragen werden. Aus
der Steigung und den Achsenabschnitten lassen sich dann v max und K M herleiten. Außerdem
kann auch die Berechnung der kinetischen Parameter durch eine Anpassung der Meßdaten
über Computerprogramme erfolgen. Das ist besonders in Hinblick auf mögliche
Inhibitormodelle nützlich.
1
v
1
v max
Abbildung 12.2
-
1
K M
Auftragung nach Lineweaver and Burk
1
[S]

Einführung in die Biotechnologie - 67 - Scheper, TCI Hannover
Für die Reaktionstechnik lassen sich solche Berechnungen aus einfachen
Überlegungen herleiten. Zuerst wird die Michaelis-Menten-Gleichung in die Bilanzgleichung
für einen Satzreaktor eingefügt:
dc
− =
dt
v
K
max
M
⋅ c
+ c
(x.8)
Daraus kann man zunächst die Zeit t, nach der ein Umsatz U erreicht ist, besser
berechnen. Die Anfangskonzentration des Substrats c 0
bei der Anfangszeit t = 0 und
die aktuelle Konzentration c bei t:
c
t
KM
+ c
−∫
⋅ dc
= ∫dt. (x.9)
v ⋅ c
0
c max
0
Das Integral auf der linken Seite wird aufgespalten:
c
c
t
K
−∫ M ⋅ c −∫ ⋅ c = ∫ t = t
v
d 1
ln
v
d d
0 0
c
max
c
max
0
(x.10),
um zu der folgenden Lösung zu gelangen:
K
v
M
max
0 0
c c − c
⋅ ln + = t . (x.11)
c v
max
Die Einführung des Umsatzes mit U c 0
−
=
c
0
und c = c 0 ( 1 −U)
führt nach
c
Umformung zu:
K 1 M
c t
ln
1
0
⎡ ⎤
⋅
v ⎣⎢ U 1−
U ⎦⎥ + v
= U
(x.12)
max
Aus der Auftragung von t U gegen ⎡ 1 1
⋅
⎣⎢ U
ln ⎤
1 −U⎦⎥
lassen sich aus der Steigung K M
v max
0
c
und aus dem Achsenabschnitt herleiten. Diese Berechnung der kinetischen
vmax
Parameter ähnelt der Lineweaver-Burk-Auftragung, ist aber den für technische
Enzymprozesse eher gebräuchlichen Meßgrößen angepaßt. Rechnerprogramme
können so direkt aus dem Verlauf des Umsatz gegen die Zeit eines Enzymprozesses
die kinetischen Daten berechnen.
max
12.5 Abweichungen vom Michaelis-Menten-Modell
Bei den meisten enzymatischen Reaktionen kommt es jedoch zu Abweichungen. So können
beispielsweise Inhibitoren die enzymatische Aktivität beeinflussen. Sogenannte kompetitive
Inhibitoren konkurrieren mit dem eigentlichen Substrat um das aktive Zentrum des Enzyms.
Dabei wird die Reaktionsgeschwindigkeit herabgesetzt, da die Wahrscheinlichkeit, daß ein

Einführung in die Biotechnologie - 68 - Scheper, TCI Hannover
Enzym-Substratkomplex gebildet wird, kleiner ist. Diese Inhibierung läßt sich aber durch eine
hohe Substratkonzentration zurückgedrängen, da die Wahrscheinlichkeit der Bildung des
Komplexes zunimmt, und die maximale Reaktionsgeschwindigkeit v max
kann wieder erreicht
werden. Kompetitive Inhibitoren können auch die Substrate oder Produkte sein.
Bindet ein Inhibitor nicht an dem aktiven Zentrum, sondern an einer regulatorischen
Einheit eines Enzyms, kann durch eine Konformationsänderung auch die Enzymaktivität
herabgesetzt werden. Diese nicht-kompetitive Inhibierung läßt sich nicht durch eine
Erhöhung der Substratkonzentration zurückdrängen. Beide Hemmtypen lassen sich leicht im
Lineweaver-Burk-Plot erkennen. Weitere kinetische Betrachtungen und Hemmtypen
(unkompetitive Hemmung, Substrat- oder Produkthemmung) sind in den Lehrbüchern
ausführlich beschrieben.
12.6. Enzymimmobilisierung
Für die technische Nutzung von Enzymen muß die Stabilität, die Abtrennbarkeit und die
Wiederverwendbarkeit der Biokatalysatoren geklärt werden. Beispielsweise sind die
technischen Enzyme zur Stärkeverzuckerung billig und unterliegen im Prozeß einer
Desaktivierung. Eine Wiederverwertbarkeit ist nicht nötig. Sobald aber die Enzymkosten ein
entscheidener Faktor bei den Produktionskosten sind, muß eine Wiederverwertbarkeit der
Enzyme in Betracht gezogen werden. Eine Wiedergewinnung der Enzyme mit den bei der
Herstellung verwendeten Methoden (Chromatographie, Ultrafiltration) ist im allgemeinen zu
teuer. Besser sind Methoden zur Enzymimmobilisierung, also Techniken, die das
„Molekulargewicht“ der Enzyme drastisch erhöhen und sie so vom Prozeßbeginn an
zurückhalten. Grob kann man zwei Klassen von Immobilisierungsmethoden unterscheiden:
Die Immobilisierung durch Kupplung und die Immobilisierung durch Einschluß. Beide
Gruppen können wieder in Untergruppen eingeteilt werden.
Immobilisierung durch Kupplung:
- Adsorptive Bindung: Die Enzyme adsorbieren an Trägermaterialien mit großen
Oberflächen (z.B. Tone, Silicagele, modifizierte Dextrane). Vorteilhaft ist, daß
diese Immobilisierungstechnik einfach durchzuführen ist und die Proteinkonformation
kaum durch die geringen Wechselwirkungskräfte beeinträchtigt
wird. Andererseits werden die Enzyme leicht abgespült, und das Aufbringen
definierter Enzymmengen ist schwierig.
- Ionische Bindung: Die Bindung an feste Träger erfolgt hier über ionische Kräfte zwischen
der Oberfläche und geladenen Gruppen der Proteine. Basische und saure
Ionenaustauscherharze (z.B. DEAE-Sepharose) sind geeignete Träger. Die Vor- und
Nachteile entsprechen denen der adsorptiven Bindung. Die Beeinflussung der Bindung
durch äußere Faktoren ist erheblich. So können Änderungen im pH-Wert zur Abtrennung
der Proteine führen, da die Ladung der funktionellen Gruppen geändert wird.
- kovalente Bindung: Diese Immobilisierung, bei der eine echte Bindung zwischen der
Trägeroberfläche und dem Enzym etabliert wird, gilt als stabilste Immobilisierungstechnik.
Die Abtrennung des Enzyms kann nur durch Auftrennung der chemischen Bindung
erfolgen. Meist wird ein aktivierter Träger-eingesetzt, der mit den in Aminosäuren
vorkommenden Sulfhydryl-, Carboxyl-, Hydroxyl-, Imidazol- oder Phenolgruppen des
Enzyms reagiert. Hydroxylgruppen an Gläsern oder Polymeren lassen sich dazu aktivieren
(z.B. Bromcyanaktivierung,Epichlorhydrinaktivierung) oder Carboxylgruppen (z.B.

Einführung in die Biotechnologie - 69 - Scheper, TCI Hannover
Chloridaktivierung). Eine Immobilisierung der Enzyme ist oft mit einer
Aktivitätsverminderung verbunden. Die Kopplung der Enzyme erfolgt meist nicht direkt
an der Oberfläche desTrägers. Beide können durch Kohlenwasserstoffketten mit
verschiedener Kettenlänge (Spacer) getrennt werden. Bei der Epoxidaktivierung durch
Epichlorhydrin ist nur ein kleiner Spacer (3-C) zwischen Träger und Enzym vorhanden,
während bei der Aktivierung mit 1,4 Butandioldiglycidether eine Spacerlänge von10 C-
Atomen erreicht wird. Proteine werden so flexibler angebunden. Das Quellen der
Polymerträger führt zu einer geringeren Beanspruchung der Enzymkonformation.
Bei der Immobilisierung wird die Konformation des Enzyms mehr oder weniger stark
beeinträchtigt. Die kovalenten Bindungen können die Konformation so verändern, daß die
Aktivität beeinträchtigt wird. Das Enzym kann auch so fixiert sein, daß das aktive Zentrum
nicht mehr zugänglich ist. Andererseits kann gebundenes, aktives Protein durch die
kovalenten Bindungen in seiner Konformation stabilisiert werden. Insgesamt kann man
sagen, daß ein Teil des fixierten Enzyms seine Aktivität verloren hat, daß aber das
gebundene aktive Enzym eine höhere Langzeitstabilität aufweist als ungebundenes Enzym.
Außerdem sind gebundene Enzyme meist stabiler gegenüber einem Angriff von Proteasen.
- Cross linking: Hier werden bifunktionelle Vernetzermoleküle verwendet, die mit
funktionellen Gruppen der Enzyme reagieren. Die einzelnen Proteine werden so in
einem Netzwerk miteinander verbunden. Oftmals müssen inerte Substanzen mit
coimmobilisiert werden (co-cross-linking), um ein festes Netzwerk zu erhalten. Die
Kontrolle der Immobilisierung ist schwierig und die Restaktivitäten sind oftmals gering,
da u. U. die Enzymkonformation stark verändert wurde oder die Enzyme nicht
mehr frei zugänglich sind.
Immobilisierung durch Einschluß
- Matrixeinhüllung: Durch gezielte Polymerisation werden die Enzyme in einer homogenen
Phase in eine kugel- oder schlauchförmigen Matrix eingeschlossen. Dies Membran
muß für die Produkte und Edukte durchlässig sein, nicht aber für die Enzyme.
Schwierigkeiten ergeben sich bei der Polymerisationsführung, da häufig auch die
Monomere auch mit den Enzymen reagieren.
- Membranabtrennung: Über eine Membran werden die Enzyme zurückgehalten.
Hierzu können feste (z.B. Ultrafiltrationsmembranen) oder flüssige Membranen verwendet
werden. Sie halten die Enzyme zurück, und die niedermolekularen Produkte
und Substrate können die Membran passieren. Hierbei ist es besonders vorteilhaft, daß
die Enzyme in homogener Phase vorliegen, so daß auch coenzymabhängige Reaktionen
in diesen Systemen (siehe Kapitel Enzymreaktoren) durchführbar sind.
Bei der Membranabtrennung mit flüssigen Membranen sollen die Phaseneinhüllung und
die „reversen Micellen“ erwähnt werden. Bei der Phaseneinhüllung erfolgt die
Immobilisierung in einer Wasser-in-Öl Emulsion oder in Phospholipiddoppelschichten
(Liposomen). Für die Herstellung von Flüssigmembranemulsionen wird die Enzymphase
in einer geeigneten Ölphase emulgiert. Die Enzymemulsion kann dann in einer wäßrigen
Substratphase dispergiert werden. Außerdem lassen sich Enzyme in sogenannten „reversen

Einführung in die Biotechnologie - 70 - Scheper, TCI Hannover
Micellen“ in organischen Phasen fixieren. Mit geeigneten Tensiden werden dazu in der
organischen Phase Wassermicellen etabliert, in denen die Enzyme löslich sind.
Schwierigkeiten ergeben sich, wenn die organischen Phasen die Enzyme denaturieren.
Zu diesen Grundtypen der Enzymimmobilisierung gibt es in der Forschung eine Fülle von
Varianten. Diese sind jedoch relativ neu und noch kaum für den technischen Einsatz
verwendbar. Auch die Reaktionsführung in organischen Lösungsmitteln, in denen die
Enzyme meist dispergiert werden oder in überkritischen Reaktionsphasen (z.B.
Kohlendioxid) werden von verschiedenen Autoren als Immobilisierungstechniken
bezeichnet, da sich die Biokatalysatoren nach der Reaktion erleichter abtrennen lassen.
12.7 Kinetik immobilisierter Enzyme
Bei der Immobilisierung von Enzymen auf festen Trägern möchte man auf wenig
Trägermaterial viel frei zugängliches Enzym immobilisieren. Das heißt, daß man einen Träger
mit großer Oberfläche benötigt, also einen porösen Träger. Bei der Immobilisierung kann ein
Teil der Enzymaktivität durch Denaturierung (extreme Konformationsänderung) oder durch
ungünstiges Fixieren am Träger (katalytisches Zentrum ist nicht mehr frei zugänglich)
verloren gehen. Dies kann man durch eine Bilanzierung der Proteinkonzentration und der
Enzymaktivität feststellen. Bekannt ist die eingesetzte Enzymmenge in Aktivitätseinheiten
und deren Konzentration. Anschließend wird im Überstand und im ersten Waschpuffer die
Restaktivität und Proteinkonzentration bestimmt. So läßt sich einfach bestimmen, wieviel
Protein auf dem Träger gebunden wurde. Ist die Menge des aktiven Enzyms auf dem Träger
auch einer Aktivitätsmessung mit dem Immobilisat zugänglich, kann man berechnen, wieviel
des gebundenen Proteins aktives bzw. inaktives Enzym ist.
Wichtig ist aber auch, daß durch die porösen Träger zwar eine große Oberfläche vorhanden,
diese jedoch unterschiedlich gut zugänglich ist. Diese Tatsache ist aus der allgemeinen
heterogenen Katalyse bekannt. Die Substrate müssen aus der Kernströmung über eine
laminare Grenzschicht um den Katalysator (Film) durch die Poren zu dem Enzym gelangen.
1
2
v
v max
v max
ohne Hemmung
Diffusionshemmung
Abbildung 12.3 Vergleich der Michaelis-Menten-Kinetik einer enzymatischen Reaktion mit und ohne
Diffusionshemmung
[S]

Einführung in die Biotechnologie - 71 - Scheper, TCI Hannover
Der Stofftransport durch den Film und die Poren erfolgt durch reine Diffusion. Jeder
einzelne Schritt kann die gesamte Reaktion limitieren (Film- bzw. Porendiffusionshemmung).
Um herauszufinden, ob eine Diffusionshemmung vorliegt, können die Michaelis-Menten- und
die Lineweaver-Burk-Auftragungen der enzymatischen Reaktion des freien und des
immobilisierten Enzyms helfen. Diese sind in den Abbildungen x.3 und x.4 gezeigt.
Bei der Michaelis-Menten-Auftragung macht sich die Diffusionshemmung durch
einen veränderten K M -Wert bemerkbar. Durch die Hemmung ist die aktuelle
Kernkonzentration nicht am Enzym zugänglich. Der Stofftransport ist erst bei hohen
Substratkonzentrationen ausreichend groß (großer Gradient), daß das Enzym optimal mit dem
Substrat wechselwirken kann. Ab einer hohen Substratkonzentration wird die übliche
maximale Reaktionsgeschwindigkeit erreicht.
Auch in der Lineweaver-Burk-Auftragung wird dieser Effekt deutlich. Hier weicht die
reziproke Reaktionsgeschwindigkeit bei kleinen Substratkonzentrationen (hohe reziproke
Werte) extrem von der „ungehemmten“ Kinetik ab.
1
v
Diffusionshemmung
1
v max
ohne Hemmung
1
1
K M
[S]
Abbildung 12.4
Diffusionshemmung in der Lineweaver-Burk-Auftragung
Die Kinetik der Gesamtreaktion kann auch durch pH-Gradienten in den Poren
beeinflußt werden. Entstehen bei der enzymatischen Reaktion Produkte, die den pH-Wert
beeinflussen, kann sich innerhalb der Poren ein pH-Gefälle aufbauen (siehe Abbildung x.5).
Der pH-Wert in der Kernströmung entspricht dann nicht mehr den in den Poren. Hier kann
das Enzym ineffektiv arbeiten. Wird die enzymatische Aktivität eines Trägers gemessen,
ergeben sich Aktivitätswerte, die denen der tatsächlich immobilisierten Enzymmenge nicht
entsprechen. Die Effektivität des immobilisierten Biokatalysators sinkt.

Einführung in die Biotechnologie - 72 - Scheper, TCI Hannover
Substrat
pH-Gradient
Produkt
Enzym
Abbildung 12.5 Aufbau eines pH-Gradienten innerhalb einer Pore bei der Bildung von
Reaktionsprodukten, die den pH-Wert beeinflussen.
12.8 Beipiele für Enzymreaktoren
Typ Satzreaktor
Die Gewinnung von 6-Aminopencilliansäure (6-APS) aus fermentativ hergestellten Penicillin
G ist ein industriell wichtiger Prozeß, da das 6-APS als Ausgangssubstanz für verschiedene
halbsynthetische Penicilline eingesetzt wird. Die enzymatische Umsetzung kann mit
Pencillin-G-amidase erfolgen, wie das Reaktionsschema zeigt:
H
CH 2 COOH
O
N
O
N
S
CH 3
CH 3
COOH
Pen-G-Amidase
H 2 O
Phenylessigsäure
Penicillin G
+
H 2 N
O
N
S
CH 3
CH 3
COOH
6-Aminopenicillansäure
(6-APA)
Abbildung 12.6
Reaktionsschema für die enzymatische Spaltung von Penicillin G zur 6-APS Produktion
Für diesen Prozeß müssen -Lactamase-freie Enzyme verwendet werden, da sonst der
-Lactamring gespalten wird. Weiterhin ist es wichtig, daß die Produktinhibierung bei der
Reaktionsführung beachtet wird, da die Ausbeuten möglichst an 100 % heranreichen sollen.
Das Enzym wird im allgemeinen auf porösen Trägern kovalent gebunden und in einem
Satzreaktor in der Substratlösung suspendiert. Der pH-Wert wird durch Laugezugabe im
Bereich von pH 7 bis 8 bei physiologischen Werten gehalten (Abbildung x.7).

Einführung in die Biotechnologie - 73 - Scheper, TCI Hannover
pH-Messung
und Kontrolle
Lauge
Träger mit immobilisierter
Penicillin-G-Amidase
Abbildung 12.7
6-APS Gewinnung in einem Rührkesselreaktor mit immobilisierten Enzymen
Festbettreaktor
Der erste kommerzielle Prozeß mit immobilisierten Enzymen wurde von Tanabe Seiyaku in
einem Festbettreaktor durchgeführt. Es geht dabei um die
L-Aminosäureherstellung aus DL-Acetyl-Aminosäure in einer durch Aminoacylasen
katalysierten enantioselektiven Hydrolyse (Abbildung x.8).
H 2 O+(D, L)-R
COOH
Enzym
L-Aminosäur e + D-Aminoacyl-AS + CH 3 COOH
NHCOR'
Aminoacyl-Aminosäure
(racemisch)
Abbildung 12.8
Reaktionsschema der enzymatischen Esterhydrolyse zur L-Aminosäuregewinnung
Um möglichst hohe Umsätze zu erreichen, muß die zurückbleibende D-Acetylverbindung
abgetrennt und durch Wärmebehandlung reracemisiert werden. Bei der Aufarbeitung
werden die Löslichkeitsunterschiede von Edukt und Produkt ausgenutzt. Die Abbildung x.9
zeigt ein Fließschema des industriell eingesetzten Prozesses zur L-Aminosäureherstellung:

Einführung in die Biotechnologie - 74 - Scheper, TCI Hannover
D,L-Acetylaminosäure
D,L-Acetylaminosäure
Tank
Aminoacylase
Festbett
Kristallisation
Reracemisieren
der
D-Acetylaminosäure
erwärmen
Separator
kristalline
L-Aminosäure
Abbildung 12.9
Ablaufschema des Tanabe-Prozesses zur enzymatischen Darstellung von L-Aminosäuren
In diesem Beispielprozeß wird DEAE-Sephadex (ionische Bindung) als
Immobilisierungsmatrix gewählt, um L-Methionin, L-Phenylalanin und L-Valin herzustellen.
Der Träger ist zwar teuer, doch rechtfertigen lange Standzeiten seinen Einsatz: in fünf
Wochen sinkt die Aktivität auf ca. 60%. Außerdem kann der Träger regeneriert werden. Der
Prozeß wird in einem 1-m 3 -Reaktor bei 50-70 o C und einem pH-Wert von 7 ausgeführt.
Durch den Einsatz dieses Systems konnten die Preise für L-Aminosäuren halbiert werden.
Es existieren für Festbettreaktoren in der Enzymtechnik folgende Nachteile:
- hoher Druckabfall
- Katalysatorinaktivierung
- Diffusionshemmung
- komplizierte Reaktionsführung
- pH-Wert-Regulierung
Auch die 6-APS-Herstellung wäre prinzipiell in einem Festbettreaktor möglich
(Abbildung x.10). Da aber saure Reaktionsprodukte entstehen, würde der pH-Wert als
Funktion des Orts im Reaktor absinken (siehe Pfeil), was sich proportional auf die
Enzymaktivität auswirken würde. Das Festbett wäre, bezogen auf die enzymatische Reaktion,
ineffektiver als ein Satzreaktor. Über den Reaktor müßte der pH-Wert konstant gehalten
werden. Prinzipiell ginge das über eine drastische Erhöhung der Pufferkapazität der
Substratlösung oder durch Laugezugabe nach dem Prinzip eines Kreuzstromreaktors.

Einführung in die Biotechnologie - 75 - Scheper, TCI Hannover
Festbett mit Penicillin-G-Amidase
0
pH
9
7
5
3
Aktivität der
Amidase
in Richtung
Ausgang
des Reaktors
0
pH-Wert am
Reaktoreingang
Ort
9 pH
Abbildung 23.10
Ausbildung eines pH-Gradienten in einem Festbett und die Auswirkung auf die Enzymaktivität
Festmembranreaktoren
Eine interessante Variante eines Enzymreaktors stellt der Festmembranreaktor dar. In ihm
können die Biokatalysatoren in homogener Phase reagieren. Die Enzyme müssen also nicht
vor dem Einsatz auf festen Trägern immobilisiert werden. Aktivitätsverluste durch den
Fixierungsschritt, Konformationsänderungen und damit verbundene Änderungen der
kinetischen Parameter und Probleme wie die Diffusionslimitierung treten nicht auf.. Die
Funktionsweise ist in Abbildung x.11 dargestellt. In den Reaktionsraum, in dem die Enzyme
in gelöster Form vorliegen, werden die Edukte gepumpt. Die enzymatische Reaktion findet
hier statt. Über eine Ultrafiltrationsmembran mit einem bestimmten Ausschlußverhalten
können niedermolekulare Verbindungen der Reaktor verlassen, während die hochmolekularen
Enzyme zurückgehalten werden. Der Umsatz hängt dann von der Enzymaktivität und der
Verweilzeit im Reaktionsraum ab. Bei Bedarf können frische Enzyme neu zugegeben werden.
Die Filtrationsfläche kann limitierend sein. Ultrafiltrationsmodule (siehe Abbildung x.12)
werden dann eingesetzt, um eine große Austauschfläche zu garantieren. Die wäßrige Phase
wird durch das Reaktorsystem gepumpt. Die Prozeßführung (Pumpen, Zufütterung) und -
beobachtung (Analyse) verläuft automatisch. Die Produkte werden über das Filtrationsmodul
abgezogen.

Einführung in die Biotechnologie - 76 - Scheper, TCI Hannover
Edukte
Ultrafiltrationsmembran
Reaktionsraum
mit Enzymen
Produkte
Fritte
Abbildung 12.11 Prinzip des Festmembranreaktors
Edukt
Edukt
Ultrafiltrationsmembran
Produkt
Produkt
Prozeßführung
und -regelung
Abbildung 12.12 Einsatz von Ultrafiltrationsmodulen für den Festmembranreaktor
Dieses Reaktorsystem wurde für die industrielle Herstellung von L-Aminosäure von
Wandrey und Kula optimiert. So können L-Aminosäuren ähnlich zum Tanabe-Prozeß durch
Hydrolyse von N-Acetyl-D,L-Aminosäure oder durch reduktive Aminierung aus den
korrespondierenden -Ketosäuren hergestellt werden. Während bei der Hydrolysereaktion
nur Um-
Industrieller Prozeß
Von der Degussa AG wurde vor ungefähr 20 Jahren ein industrieller Prozeß zur
Darstellung von L-Methionin in einem Membranreaktor etabliert. Diese Anlage wird heute
von der Great Lake Chemicals in Konstanz betrieben und produziert ca. 300 t L-Methionin
pro Jahr. Dazu wird - wie aus der Prozeßskizze hervorgeht - Aminoacylase aus Aspergillus
oricae in Hohlfasermodulreaktoren immobilisiert. Dieses Enzym spaltet mit hoher
Umsatzgeschwindigkeit N-Acetyl D,L-Methionin. L-Methionin entsteht, und das
zurückbleibende ND-Methionin wird reracemisiert und in den Prozeß neu eingespeist. Die
Acylase aus Aspergillus oricae hat eine breite Spezifität, kann also verschiedene Acetyl-
Aminosäureester umsetzen, jedoch ist die Wirtschaftlichkeit bei der Darstellung von L-
Methionin aus dem chemisch hergestellten
D,L-Methionin am größten. L-Methionin ist als Tierfutterzusatz von großem Interesse.

Einführung in die Biotechnologie - 77 - Scheper, TCI Hannover
Abb. 12.13 L-Methionindarstellung im industriellen Festmembranreaktor in homogener Phase
Der Gesamtprozeß setzt sich aus folgenden Einzelschritten zusammen:
1. Die Acetylierung von D,L-Methionin erfolgt mit Essigsäureanhydrid im alkalischen
Milieu. Das N-Acetyl-D,L-Methionin wird dann in einer wäßrigen Phase
(ca. 0,6 mol/l) im neutralen pH-Bereich in den Enzymmembranreaktor eingespeist.
2. Die enzymatische Reaktion wird in einem neutralen bis leicht alkalischen pH-Bereich
bei Temperaturen um 30 °C durchgeführt. Die eingesetzte Acylase hat eine Aktivität
von ca. 30.000 units/g Enzym. Sie wird im Konzentratstrom des Hohlfasermembranreaktors
zurückgehalten. Aktivitätsverluste können durch Einspeisung frischer
Enzymlösungen ausgeglichen werden. Ein Enzymmembranreaktormodul besteht aus
ca. 100 m 2 Membranfläche. Die Ausschlußgrenze der Membran liegt bei 10.000
Dalton. Die Substrate und Produkte haben ein Molekulargewicht von unter 200 Dalton
und können die Membran problemlos passieren. Im Membranreaktor werden
Umsatzgrade von ca. 80% erzielt. In der Produktlösung befinden sich L-Methionin
und N-Acetyl-D-Methionin.
3. Die Produktlösung wird, wie anschließend im Schema angezeigt, eingedampft und
nach Behandlung mit Aktivkohle bei verschiedenen Temperaturen zwischen 55 °C
und 30 °C auskristallisiert. Die Kristalle werden gewaschen, getrocknet und der

Einführung in die Biotechnologie - 78 - Scheper, TCI Hannover
Endreinigung zugeführt. Die Mutterlauge aus der Kristallisation wird
chromatographisch gereinigt und das darin enthaltene N-Acetyl-D,L-Methionin (der
Anteil
des
D-Enantiomeren ist sehr viel höher als der des L-Enantiomeren) auskristallisiert und
geschmolzen. Nach Zugabe von Essigsäureanhydrid racemisiert dieses Gemisch zu N-
Acetyl-D,L-Methionin (Verhältnis der Enantiomere ca. 50 : 50). Das Racemat wird
erneut in den Kreislauf eingespeist.
Die Prozeßregelung ist relativ einfach. Wird die kritische Umsatzrate im Enzymmembranreaktor
unterschritten, kann der Durchsatz erniedrigt oder frisches Enzym zugegeben werden.
Die Reaktion wird über den optischen Drehwert der Produktlösung verfolgt.
___________________________________________________________________________
sätze von 50% (ohne anschließende Reracemisierung) zu erreichen sind, können bei der
reduktiven Aminierung Umsätze von 100% erreicht werden. Für diese Reaktion ist NADH als
Cosubstrat nötig. Es wird im gleichen Reaktionsraum durch eine zweite enzymatische
Reaktion kontinuierlich zur Verfügung gestellt. Da das Molekulargewicht von NADH aber
sehr klein ist (MW= 665,4), würde es die Ultrafiltrationmembran leicht passieren. Deshalb
wurde für die Versuche molekulargewichtsvergrößertes NADH verwendet, beispielsweise
NADH, das an Polyethylengly
O
HCOOH
COOH
E 2
E 1
NH 2
COOH
+ H 2 O + CO 2
Ultrafiltrationsmembran
Ausschlußgrenze
5000 Dalton
PEG 20 000
NADH
Abbildung 12.14 Prinzip der coenzymabhängigen enzymatischen Synthese im Festmembranreaktor
zur Herstellung von L-Aminosäuren
gebunden ist (Abbildung x.13). Mit diesem Trick konnte das Molekulargewicht so vergrößert
werden, daß das Coenzym relativ einfach im Reaktionsraum zurückgehalten werden konnte.
Die Abbildung x.14 zeigt das Reaktionsschema für die Darstellung einer L-
Aminosäure (z.B. L-Leucin) aus der entsprechenden -Ketosäure (z.B. -Ketoisocaproat).
Unter Verbrauch von NADH wird die Ketogruppe in eine L-Aminogruppe überführt. Ein
Umsatz von 100 % ist prinzipiell möglich (anders als bei enantioselektiven
Racematspaltungen). Das enstehende NAD + wird in einer zweiten Reaktion, bei der Formiat
oxidiert wird, selbst reduziert. Bei der Reaktion entsteht Kohlendioxid (in Form von
Hydrogencarbonat) als Nebenprodukt. Das teure Coenzym kann nun je nach enzymatischem
System einige zehntausendmal reagieren, bis es zerstört ist. Über diese Reaktionsführung
kann der Gesamtprozeß wirtschaftlich eingesetzt werden.

Einführung in die Biotechnologie - 79 - Scheper, TCI Hannover
NH 4 OH
+
O
NH 2
Enzym 1
+ 2 H 2
O
R COOH
R COOH
NADH NAD +
CO 2
+ H 2
O
Enzym 2
HCOOH
Enzym 1 z.B.: Leucindehydrogenase (LeuDH)
Enzym 2 z.B.: Formiatdehydrogenase (FDH)
Abbildung 12.15
Reaktionsschema zur kontinuierlichen enzymatischen Darstellung von L-Aminosäuren aus den
korrespondierenden-Ketosäuren
13. Technische Anwendungen
13.1. Stärkeverzuckerung
Stärke ist aus linearer Amylose (-1,4-verknüpft) und verzweigtem Amylopektin (-1,6-
verknüpft) aufgebaut:
CH 2 OH
CH 2 OH
O
H
O H
OH O
OH
H
O H
OH O
OH
O
H
HO
CH 2
O
OH
H
OH
CH 2
O H O H
OH
HO
OH
O
α-1,4-Verknüpfung
α-1,6-Verknüpfung

Einführung in die Biotechnologie - 80 - Scheper, TCI Hannover
So entstehen verzweigte Polysaccharidketten, die je nach verwendetem Enzym an
verschiedenen Positionen gespalten werden können, z.B.:
-Amylase:
endo -1,4-Spaltung (lineare Spaltung; es entstehen Dextrine,
Maltose und Maltotiose)
-Amyloglucosidase: exo -1,4- und -1,6-Spaltung (ergibt Glucoseeinheiten)
Der Vorgang ist eine Zweischrittreaktion, bei der lösliche Enzyme eingesetzt werden. Man
kann bei der Stufe der Glucoseentstehung aufhören und die Glucose aufreinigen. Sie hat eine
Süßkraft von 70% gegenüber Saccharose, die Süßkraft der Fructose liegt demgegenüber bei
150%. Man schließt daher noch einen Isomerisierungsschritt an:
α - Amylase
(nativ)
Glucoamylase
(nativ)
Glucoisomerase
(immobilisiert)
Stärke
Dextrine
Glucose
Fructose
pH 6,0 - 6,5; T > 80°C
pH 4 - 5; T um 60°C
pH 7 - 8,5; T um 60°C
In den USA werden auf diese Weise 5,65 Millionen jato. Zuckersirup gewonnen, in Europa
hingegen nur 20.000 jato (≅ 2% des Industriezuckerbedarfs). Durch Einspeisung von 50
%iger Glucoselösung entsteht ein Zuckersirup mit einem Gehalt von 52% Glucose, 42%
Fructose und 6% Oligosacchariden. Die Süßkraft dieses Sirups entspricht derjenigen des
Haushaltszuckers.
Eckdaten: - Halbwertszeit der Enzyme: 1.000 h
- Reaktionsführung: Umsatz wird konstant gehalten, Durchsatz variiert
- Pro kg immobilisierter Glucoseisomerase können 1- 3 to Fructosesirup
hergestellt werden.
13.2 Penicillin
Der eingesetzte Biokatalysator ist die Penicillin-G-Amidase (PGA).
O
HN
O
CH 2 COOH
H CH 2 N S 3
S CH 3
Pen-G-Amidase
CH
+ H 3
2 O +
CH N
3
N O COOH
COOH
Penicillin G
Phenylessigsäure
6-Aminopenicillansäure
(6-APA)

Einführung in die Biotechnologie - 81 - Scheper, TCI Hannover
PGA wird in Polyacrylamid eingeschlossen oder in ganzen Zellen verwendet. Aus der auf
diese Weise gewonnen 6-Aminopenicillansäure (6-APA) lassen sich durch einen
anschließenden Schritt weitere Derivate des Penicillin G herstellen. Beispiel:
Ampicillinherstellung:
NH 2
O
6-APA +
NH 2
OCH 3
O
Pen-G-Amidase
CH 3 OH
N
O
N
S
CH 3
CH 3
COOH
D-Phenylglycinmethylester
Ampicillin
Ein Problem bei der technischen Herstellung stellt die Produktinhibierung durch 6-APA und
besonders durch die Phenylessigsäure dar. Ferner kommt es durch die Entstehung freier Säure
zu einem starken Abfall des pH-Wertes, der im Festbett nur schwer kontrolliert werden kann.
Die Reaktion wird daher zumeist im Satzbetreib ausgeführt.
13.3 Industrielle Nutzung ganzer Zellen
Aceton-Butanol-Gärung
Vorgeschichte:
Vor dem ersten Weltkrieg konnte Aceton petrochemisch nur schwer hergestellt werden, war
jedoch wichtig zur Darstellung von rauchfreiem Schießpulver. Daher ging man zur anaeroben
Gärung mit Clostridium acetobutylicum über. Bei der Gärung entstehen Aceton, Butanol und
Ethanol im Verhältnis 3 : 6 : 1. Butanol fand jedoch erst nach dem ersten Weltkrieg als
Lösungsmittel für die Autolackherstellung (Nitroalluloselacke) in größerem Rahmen
Verwendung.
Aceton findet Verwendung: als Lösungsmittel
als Acetylallulose Lösungsmittel
bei der Herstellung von Schießbaumwolle
bei der Herstellung von Tränengas
bei der Herstellung von Pharmaka
zur Herstellung von Acetoncyanhydrin
(Synthesegrundstoff).
Probleme der biotechnologischen Herstellung:
Mit einem Lösungsmittelgehalt von maximal 20 g/l konnten nur schlechte Ausbeuten
erreicht werden. Bei sinkenden Erdölpreisen und gleichzeitig wachsenden Preisen für
Melasse wurde die biotechnologische Herstellung daher bald vollständig durch
petrochemische Verfahren verdrängt (Hydrierung von Acetylenen, die durch Pyrolyse von
Kohlenwasserstoffen erhalten werden.). Eine großtechnische Anlage mit 10 000 jato
Lösungsmittelproduktion ist heute nur noch in China in Betrieb.
Probleme der großindustriellen Nutzung der Aceton-Butanol-Gärung waren:
- geringe Butanoltoleranz des Mikroorganismus (in der statischen Kultur beträgt
die maximal tolerable Konzentration 200 mmol/l)
- hohe Kosten bei Produktisolierung
- schlechte Raum-Zeit-Ausbeute

Einführung in die Biotechnologie - 82 - Scheper, TCI Hannover
- Produkte gehen teilweise über die Gasphase verloren. Es bilden sich explosive
Luft-Gasgemische
- hohe Rohstoffkosten
Heute wären biotechnologische Verfahren als Alternative zur petrochemischen Darstellung
interessant, wenn man mehr als 60 g/l Lösungsmittel fermentativ herstellen könnte. Ein
solches Verfahren ist heute noch nicht in Betrieb, doch werden weiterhin Möglichkeiten
untersucht, den biotechnologischen Prozeß konkurrenzfähig zu machen.
Neue Ansätze sind die Züchtung von Stämmen mit höherer Toleranz gegenüber Butanol.
Außerdem ist der Transfer der die für die Aceton-Butonol-Gärung relevanten Enzyme
codierenden Gene in resistentere Organismen denkbar.
Eine verfahrenstechnische Verbesserung des Prozesses ist die Entwicklung eines
kontinuierlichen Zweistufenprozesses mit kontinuierlicher Produktaufreinigung:
1. Stufe: Zellwachstum und Limitierung der Lösungsmittelproduktion
2. Stufe kein Wachstum und Lösungsmittelproduktion
Durch diese Prozeßführung ist eine bessere Anpassung an die Erfordernisse des
biologischen Systems gegeben. So konnten Standzeiten von einem Jahr gegenüber 200 h bei
Einstufenprozessen erreicht werden. Auf diese Weise werden zwar keine höheren Umsetze
erzielt, man erreicht aber einen stabilen Prozeß. Problematisch ist bisher noch die Abtrennung
des Lösungsmittels und Rückführung der Zellen ohne Beeinträchtigung der Aktivität.
Bedingungen für eine Gärung mit hohen Erträgen sind:
- pH < 5
- niedrige Durchflußraten (0,125 h -1 im ersten Kessel, 0,03 im 2. Kessel)
- Überschuß an vergärbarem Zucker
- Schwellenkonzentration an Butyrat
- Einsatz geeigneter wachstumslimitierender Faktoren (Phosphat, Sulfat)
- Temperatur: 37°C (1.Kessel), 33 °C (2.Kessel)
Backhefe aus Saccharomyces cerevisiae
Bei diesem Prozeß ist die Bildung von Ethanol unerwünscht, da nur Biomasse produziert
werden soll. Deshalb ist für gute Durchlüftung und hohen Stickstoffgehalt zu sorgen. Die
Atmungsaktivität wird bei Glucosekonzentrationen oberhalb von 20 mg/l reprimiert und
Ethanolbildung setzt ein. Als Substrat für die Fermentation wird Melasse, speziell
Rübenmelasse verwendet, die bei der Zuckerherstellung als Abfallprodukt anfällt. Daneben
werden wachstumsfördernde Additive zugesetzt. Das zu Beginn der Hauptgärung unter
geringer Belüftung gebildete Ethanol wird unter den nachfolgenden strikt anaeroben
Bedingungen als C-Quelle benutzt. Die Hefeerzeugung erfolgt heute ausschließlich in
Zulaufverfahren, bei denen die Nährsubstanz während der Hefeentwicklung kontinuierlich
oder diskontinuierlich zugesetzt wird.
Zum Animpfen des Fermenters kann Hefe aus vorhergehenden Fermentationen
(Versandhefe) wegen ihres hohen Anteils an Fremdorganismen und der Optimierung
hinsichtlich der Teilungsrate nicht eingesetzt werden. Geeignete Impfkulturen (Stellhefe) sind
neue Reinkulturen oder gereinigte und auf Gärung umgezüchtete Versandhefe. Die Qualität
der Stellhefe beeinflußt maßgeblich die Qualität der Versandhefe.
Herstellung von Backhefe
Reinigung/ Anzucht: Soweit keine neuen Reinkulturen eingesetzt werden, wird
zunächst der Stoffwechsel der Versandhefe in hochkonzentrierter
Zuckerlösung unter fast anaeroben Bedingungen und unter Abwesenheit
von Nährsalzen auf Gärung umgestellt. Gleichzeitig werden durch

Einführung in die Biotechnologie - 83 - Scheper, TCI Hannover
Reinzucht:
Hauptzucht:
Säurezusatz Fremdorganismen getötet oder schwer geschädigt. In einem
zweiten Schritt wird der Zuckergehalt des Nährmediums ("Würze")
vermindert und der Nährsalzgehalt erhöht. Unter schwacher Belüftung setzt
nun Vermehrung ein. Man erhält die Stellhefe.
Reinkulturen werden nach Durchlaufen einer Anzuchtprozedur in die
Reinzuchtanlage überführt.
Die Reinzuchtanlage besteht aus drei Stufen, die sich hinsichtlich der Quelle
(organisch, anorganisch) und der Menge an Stickstoff unterscheiden. Mit
der Hefe aus der dritten Stufe wird die erste Vermehrung im Betrieb
durchgeführt (I. Generation).
Die Hefe der I. Generation wird im Füllverfahren (Satzbetrieb) angesetzt.
Nach 6 - 8 h beginnt die Entwicklung der II. Generation im
Zulaufverfahren. Sie wird nach weiteren 6 - 8 h unterbrochen, bevor die
Hefezellen voll entwickelt sind. Der Extrakt kann gekühlt aufbewahrt
werden. (Aus der Reinzucht und der I. und II. Generation der Hauptzucht
lassen sich Ausbeuten von 20% Ethanol und 22% (bei guter Belüftung auch
bis zu 30%) Hefezellen erhalten.)
Aus der III. Generation wird die Versandhefe erzeugt. Dazu wird mit der
20 - 25% der zu erwartenden Hefe angeimpft. Zunächst werden bei pH 2 -
2,5 (1-2 h) erneut keimarme Bedingungen geschaffen. Als Reaktor werden
geschlossene 50-400 m³ Tanks aus V2A-Stahl oder Aluminium verwendet.
Nach 1 - 2 h setzt die Vermehrung ein und ist nach weiteren 9 - 12 h abgeschlossen.
Die Temperatur steigt währenddessen von 25°C auf 30°C an, das
Medium wird durch NH 3 /NH 4
+-Puffer auf pH 4,2 - 4,8 gehalten. Zur
Schaumunterdrückung werden dem Medium Antischaummittel (Wollfett,
langkettige Paraffinsulfonate, Silicone) zugesetzt.
Aufarbeitung: Nach Beendigung des Zulaufs schließt sich eine Reifephase unter
verminderter Belüftung an. Anschließend wird die Hefe mit Separatoren
abgetrennt, gewaschen, erneut abgetrennt und unter Kühlung durch
Rahmenfilterpressen abgepreßt. Die Hefe wird mit einem Wassergehalt von
67 - 71% gelagert und gelangt mit 72 - 77%igem Wassergehalt in den
Verkauf.
Betriebskontrolle des Zulaufverfahrens:
zu kontrollierende Parameter: - pH-Wert
- Stickstoffgehalt der Lösung
- Zuckergehalt der Würze
- Hefezuwachsrate
- Nährstoffgehalt der Würze, bestimmt aus dem
spezifischen Gewicht
- Alkoholgehalt

Einführung in die Biotechnologie - 84 - Scheper, TCI Hannover
14. Weiterführende Literatur
Karl Schügerl
Bioreaktionstechnik Band I und II
Salle und Sauerländer
ISBN: 3-7935-5539-9
ISBN: 3-7935-5538-0
Octave Levenspiel
The Chemical Reactor Omnibook
OSU Book Stores, Inc.
ISBN: 0-88246-160-5
Harvey Land/
Douglas Clark
Biochemical Enineering,
Marcel Dekker, Inc.
ISBN: 0-8247-0099-6
James Bailey/
David Ollis
Biochemical Engineering Fundamentals
McGraw-Hill
ISBN: 0-07-003212-2
Pauline M. Doran
Bioprocess Engineering Principles
Academic Press
ISBN: 0-12-220856-