Querschnitt 21 / Februar 2007 - h_da: Hochschule Darmstadt

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QUERSCHNITT 21 oder Schutzgruppe blockiert sein, damit es von einer Exopeptidase überhaupt umgesetzt werden kann. TAMEP wiederum ist eine Metalloprotease, die die Peptidbindung auf der Aminoseite der für die Erkennung spezifischen Aminosäure hydrolysiert. Solche Proteasen heißen auch P1’-Proteasen. Als Endoprotease, die Peptidbindungen im Inneren eines Proteins öffnet, benötigt TAMEP Substratmoleküle mit Schutzgruppen bzw. Farbstoffen an beiden Enden des Peptids. 3 • Für die Etablierung eines Enzymaktivitätstests von P1’-Proteasen wie TAP stehen käufliche chromogene Peptidsubstrate zur Verfügung Die Messung der Aktivität von Proteasen mit P1-Spezifität ist denkbar einfach. Dadurch, dass eine Peptidbindung C-seitig geöffnet wird, benötigt man nur einen Farbstoff, der durch die Bindung an die terminale Carboxylfunktion eines geeigneten Peptids seine optischen Eigenschaften ändert. Im einfachsten Fall wird Nitroanilin mit dem spezifischen Peptid verknüpft. Dadurch wird der mesomere Donorcharakter der aromatischen Aminofunktion geschwächt und das Gesamtmolekül erscheint farblos, weil es keine Absorption im Wellenlängenbereich des sichtbaren Lichts besitzt. Wird Nitroanilin im Aktivitätstest durch die Protease freigesetzt, kommt es zu einer Rotverschiebung des Absorptionsmaximums, wodurch eine messbare Gelbfärbung der Lösung hervorgerufen wird (Abbildung 3.1). Nitroanilierte Peptide mit den unterschiedlichsten Sequenzen sind käuflich erhältlich. Obwohl die Tripeptidylaminopeptidase ihr Aktivitätsoptimum nur mit Tripeptiden erreicht, setzt sie mit einer um eine Größenordnung niedrigeren Umsatzrate auch Dipeptide und, wie wir erstmals zeigen konnten, Tetrapeptide um [3]. Mit einem käuflichen Nitroanilidpeptid, das die notwendige Sequenz Alanylprolin (AP) aufwies, wurde entsprechend ein ausreichend sensitiver Aktivitätstest etabliert [3]. Die Synthese einer Verbindung mit der Sequenz RAP oder gar FRAP lohnte nicht. 50 � � � � �� Abbildung 4 • Proteolytische Spaltung von Furylacryloylglycylphenylalanylamid (FAGFA) durch TAMEP. Die zu öffnende Peptidbindung ist violett hervorgehoben. �� Abbildung 5.2 • Hydrolyse von DABCYL-Serinylphenylalanyl-EDANS durch Dispase oder Thermolysin. Die zu öffnende Peptidbindung ist violett hervorgehoben. � � � �� Ähnliche chromogene Substrate können auch für Aktivitätstests anderer Enzymklassen verwendet werden. Voraussetzung ist nur, dass Elektronendonorgruppen durch die Kopplung an das spezifische Substratmolekül ihren Einfluss auf ein Pi-System, in der Regel ein Aromat, verändern. Zwei Beispiele für solche Systeme zeigt Abbildung 3.2. 4 • Für P1’-Proteasen wie TAMEP sind keine sensitiven chromogenen Peptidsubstrate herstellbar Die Aktivitätsbestimmung von P1’-Proteasen ist wegen der Nseitigen Öffnung von Peptidbindungen komplizierter. Das primäre Produkt, die N-terminale Hälfte des Proteinsubstrats, erhält durch die enzymatische Spaltung eine freie α-Carboxylfunktion. In Analogie zu den oben beschriebenen Peptidylaniliden müsste ein artifizielles Substratpeptid konstruiert werden, das während der Hydrolyse eine Änderung der optischen Eigenschaften an der gebildeten Säurefunktion durch Änderung der elektronischen Eigenschaften erfährt. Ein solches Molekül ist bisher nicht bekannt, zumindest nicht mit der Sensitivität von Nitroaniliden. Beschrieben sind lediglich Furylacryloylpeptide, deren Absorption bei 340 nm durch Hydrolyse der einzigen Peptidbindung erniedrigt wird (Abbildung 4) [5]. Das Signal ist schwach, und es bleibt unklar, weshalb sich die Absorptionsintensität überhaupt ändert. Möglicherweise steht die Carboxylfunktion über ihr Enol mit dem konjugierten Pi- System des Furylacyroylglycins in Wechselwirkung und zieht dadurch Elektronendichte ab, was zur Verringerung der UV- Absorption führt. 5 • Die Aktivität von P1’-Proteasen kann mit fluoreszierenden Systemen kontinuierlich gemessen werden Für Enzyme, deren Substratmoleküle wie bei P1’-Endoproteasen in verschiedene Teile zerfallen, können auch Fluoreszenzsonden als Signalgeber verwendet werden. Gegenüber photometrischen Messungen haben sie den Nachteil, dass aus der Emissionsintensität nur eingeschränkt der Umsatz ermittelt Konstruktion eines Peptids mit gelöschter Fluoreszenz und Etablierung eines Aktivitätstests zur Bestimmung von P1’-Proteaseaktivität �� FACHBEREICH CHEMIE UND BIOTECHNOLOGIE �� Abbildung 5.1 • Anregungs- (grau) und Emissionsspektren (violett) von (2-Aminoethyl)aminonaphthyl-5-sulfonsäure (EDANS) und 4-(4’-N,N-Dimethylaminophenyl)azobenzoesäure (DABCYL) (Quelle: [6]). werden kann, also der Zerfall des Ausgangsstoffs bzw. die Bildung der Produkte. Deshalb wird die Reaktionsgeschwindigkeit meist nur in einer Zu- oder Abnahme der relativen Fluoreszenz je Zeiteinheit ausgedrückt. Dass dennoch in der Literatur die Beschreibung neuer Enzymtests mit fluoreszierenden Substraten weiter zunimmt, ist in erster Linie ihrer extrem hohen Empfindlichkeit zuzuschreiben. Die Enzymaktivität von P1’-Endoproteasen lässt sich kontinuierlich messen, wenn ein gegebenes Peptid entweder zwei Fluoreszenzfarbstoffe oder einen Fluoreszenz- und einen Löschfarbstoff trägt. Das Messsignal entsteht dadurch, dass einer der beiden Farbstoffe, der Donorfarbstoff, durch Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) Anregungsenergie auf den Akzeptorfarbstoff überträgt, der nachfolgend Photonen emittiert (zweiter Fluoreszenzfarbstoff) oder die absorbierte Energie durch Rotation und Molekülschwingung dissipiert (Löschfarbstoff). Voraussetzung für den Energieübertrag ist, dass zum einen das Emissionsspektrum des Donors mit dem Absorptionsspektrum des Akzeptors überlappt und zum anderen ein geeigneter Abstand zwischen den Farbstoffmolekülen besteht. Für Proteasen wird eine Kombination aus Fluoreszenz- und Löschfarbstoff bevorzugt, weil durch die enzymatische Spaltung des Substratmoleküls ein positives Signal erzeugt wird, also ein kontinuierliches Ansteigen der Fluoreszenzintensität. Am häufigsten ist in der Literatur das FRET-Paar DAB- CYL-EDANS beschrieben, weil das Absorptionsspektrum des Azofarbstoffs DABCYL das Emissionsspektrum des Naphthalinderivats EDANS fast vollständig überdeckt (Abbildung 5.1). Dadurch ist eine gute Energieübertragung gewährleistet. DABCYL-EDANS-Peptide wurden für verschiedene Endoproteasen synthetisiert, wobei in allen Fällen längere, also kostenintensive Peptide mit 6 – 12 Aminosäuren gewählt wurden [7 – 10]. Dies wurde zum einen mit der hohen Spezifität einer Protease begründet, zum anderen auch damit, dass die sterisch anspruchsvollen Farbstoffe die Bindung eines kleinen Peptids an das Aktivzentrum verhindern. Der zweite Grund bewegte sogar Autoren, auf die Notwendigkeit von zusätzlichen Abstandshaltern zwischen den Farbstoffen hinzuweisen [11]. Wir konnten mit Dispase und Thermolysin erstmals zeigen, dass die Länge eines Dipeptids ausreicht, um die FRET-Farbstoffe auf eine ausreichende Distanz zu halten [1]. Die Kürze des Peptids erlaubt nicht nur die kostengünstige Synthese im Grammmaßstab. Dadurch, dass das neue Substrat DABCYL- Ser-Phe-EDANS nur eine Peptidbindung enthält, ist der Angriff einer Metalloprotease definiert (Abbildung 5.2). Die Sequenz des Dipeptids Serinylphenylalanin (SF) stammt von der TAMEP-Spaltstelle im Aktivierungspeptid von pro- Transglutaminase, um die aktivierende Endoprotease weiter zu untersuchen (vgl. Abschnitt 2). Da gereinigte TAMEP nicht mehr zur Verfügung stand, wurde die Charakterisierung des 51
Querschnitt 21 E S ES E P Abbildung 6.2 • reaktionsgleichung für ein enzym, das einer Michaelis-Menten-Kinetik folgt. 200 150 100 50 Relative Fluoreszenz 0 400 450 500 550 600 Wellenlänge [nm] Abbildung 6.1a • Hydrolyse von DABCYL-Ser-Phe-EDANS durch verschiedene Proteasen: Anstieg der Fluoreszenzintensität durch Einwirkung von Dispase ( ), Thermolysin ( ), Collagenase ( ), Proteinase K ( ) und anderen Endoproteinasen ( ). Peptids und die etablierung der Messmethode mit verwandten P1’-Proteasen durchgeführt, nämlich käuflicher Dispase und Thermolysin. Dass TAMeP aller Wahrscheinlichkeit nach in gleicher Weise das Dipeptid hydrolysiert, wurde mit extrakten von Streptomyces mobaraensis inzwischen gezeigt (unveröffentlichtes ergebnis). 6 • dAbcyl-sF-edAns ist ein gutes substrat der P1’-Proteasen dispase und thermolysin Die Hydrolyse des Dipeptids mit gelöschter Fluoreszenz wurde mit verschiedenen endoproteasen untersucht. Wie erwartet, hatten nur Dispase und Thermolysin die geeignete Spezifität, um das Dipeptid rasch umzusetzen (Abbildung 6.1a). Die Katalyse von Collagenase und Proteinase K blieb gering, wobei beide Proteasen offensichtlich auch die Amidbindung zwischen Phenylalanin und eDANS unspezifisch öffnen (Abbildung 6.1b). Viele enzyme wie die hier beschriebenen Proteasen gehorchen einer einfachen Michaelis-Menten-Kinetik. Danach erfolgt der umsatz des Substrats S nur nach Ausbildung des enzym- Substrat-Komplexes eS, der wiederum in einem vorgelagerten Gleichgewicht aus dem freien enzym e und ungebundenem Substrat gebildet wird (Abbildung 6.2). eine Bedingung, die sich damit für die etablierung eines enzym- aktivitätstests ergibt, ist die, dass das enzym während des gesamten Messvorgangs substratgesättigt sein muss. Mathematisch exakt bedeutet dies, dass eine vollständige Sättigung nur erreicht wird, wenn die Substratkonzentration gegen unendlich geht. In der Praxis wird jedoch eine Substratmenge als ausreichend betrachtet, die 2 – 3 Größenordnungen über der enzymmenge liegt. Für enzym und Substrat wurden im Ak- 5 k 2 k -1 k 2 Phe-eDANS eDANS Dabcyl-Ser-Phe-eDANS 1 1 2 3 4 5 6 7 8 Abbildung 6.1b • Fragmentbildung angezeigt durch Dünnschichtchromatographie: Spuren 1 – 3, reinsubstanzen der angezeigten Verbindungen; Spuren 4 – 8, reaktionsmischungen des Dipeptids mit Dispase, Thermolysin, Collagenase, Proteinase K und Papain (entnommen aus [1]). tivitätstest mit DABCYL-Ser-Phe-eDANS entsprechend Konzentrationsverhältnisse von 0.02 bis 0.001 gewählt. Bei einem Peptid mit gelöschter Fluoreszenz kommt jedoch noch hinzu, dass die Substratkonzentration nicht unbegrenzt gesteigert werden kann. Der Anstieg der Fluoreszenz während der enzymatischen Fragmentierung nimmt ab einer bestimmten Konzentrationsschwelle nicht mehr linear zu, um schließlich ganz zum Stillstand zu kommen, weil der mittlere Abstand zwischen den Produkten in Lösung so klein wird, dass intermolekulare Fluoreszenzlöschung eintritt. Bei DABCYL-Ser-Phe-eDANS war dieser Schwellenwert bei etwa 40 µM erreicht (Abbildung 6.3). Weiterhin lieferte die vollständige Hydrolyse dieser Substratmenge, gleiche Spaltbreite von 5 nm für excitation und emission vorausgesetzt, stets einen konstanten Fluoreszenzanstieg von etwa 150 relativen Fluoreszenzeinheiten rfu. Der Wert wurde herangezogen, um enzymeinheiten, maximale Hydrolysegeschwindigkeit V max und umsatzzahl k cat berechnen zu können. Danach entspricht eine enzymeinheit, definiert als der umsatz von 1 nmol Dipeptid pro min, einem Fluoreszenzanstieg von 3.7 rfu. 7 • der Aktivitätstest mit dAbcyl-ser-Phe-edAns ist auch ein wichtiges hilfsmittel für die charakterisierung eines neuen Proteins von Streptomyces mobaraensis, das die Autolyse von dispase und thermolysin induziert. Der Aktivitätstest wurde mit Dispase weiter optimiert und zur Bestimmung der kinetischen Parameter von Dispase und Thermolysin herangezogen [1]. Wie Tabelle 7 zeigt, liegen für diese Proteasen die K m - und k cat -Werte ) des kleinen Dipeptids in einer Größenordnung, die durchaus bei längeren Peptiden 350 300 250 200 150 100 50 konstruktion eines peptids mit gelöschter Fluoreszenz und Etablierung eines aktivitätstests zur Bestimmung von p1’-proteaseaktivität Relative Fluoreszenzintensität 200 150 100 0 50 100 150 200 250 50 0 10 20 FAchbereich chemie und biotechnologie 30 40 Substratkonzentration µM Abbildung 6.3 • relative Fluoreszenzintensität nach vollständiger Hydrolyse unterschiedlicher Mengen von DABCYL-Ser-Phe-eDANS. einschubdiagramm: Der Anstieg der Fluoreszenz ist im Bereich von 40 µM Substrat linear (entnommen aus [1]) gefunden werden. Die Miniaturisierung des Aktivitätstests in ein Mikrotiterplattenformat für die Absenkung des Peptidverbrauchs und die kontinuierliche Messung von enzymaktivität steht noch aus. Der neue Aktivitätstest wird gegenwärtig in verschiedenen Projekten eingesetzt. Zum einen arbeiten wir an einem verbesserten Verfahren zur reinigung von TAMeP. Wie bereits erwähnt, können wir mit DABCYL-Ser-Phe-eDANS die Protease in Kulturbrühen und Zellextrakten von Streptomyces mobaraensis spezifisch nachweisen [17]. Zum anderen haben wir das neue Protein DAIP entdeckt, das in einen Differenzierungsprozess von Streptomyceten eingreift, aber auch das Wachstum von Schimmelpilzen hemmt [18]. Interessanterweise induziert DAIP die Autolyse von Dispase und Thermolysin, wobei noch unklar ist, ob dies durch entzug des essentiellen Zinkatoms oder Auslösen einer Konformationsänderung erfolgt [17]. Wir vermuten außerdem, dass TAMeP wie Dispase und Thermolysin von DAIP in einen Suizid getrieben wird. Wie dem auch sei, das Dipeptid mit gelöschter Fluoreszenz ist bei allen gegenwärtigen untersuchungen ein wichtiges Hilfsmittel. danksagung Die Autoren bedanken sich bei Frau Dipl.-Ing. (FH) ulrike Becher für wertvolle Hinweise und beim Zentrum für Forschung und entwicklung der Hochschule Darmstadt für finanzielle unterstützung. 2) Km gibt Auskunft über die Affinität eines Substrats zum enzym und k cat repräsentiert den umsatz von Substratmolekülen je enzymmolekül und Zeiteinheit literatur 1 • Weimer, s., Oertel, K. und Fuchsbauer, h.-L. (2006) A quenched fluorescent dipeptide for assaying dispase- and thermolysin-like proteases. Anal. Biochem. 352, 110 – 119. • Zotzel, J., Keller, P. und Fuchsbauer, h.-L. (2003) transglutaminase from Streptomyces mobaraensis is activated by an endogenous metalloprotease, eur. J. Biochem. 270, 3214 – 3222. • Zotzel, J., Pasternack, r., Pelzer, c., Mainusch, M. und Fuchsbauer, h.-L. (2003) Activated transglutaminase from Streptomyces mobaraensis is processed by a tripeptidyl aminopeptidase in the final step, eur. J. Biochem. 270, 4149 – 4155. • schechter, i. und Berger, A. (1967) On the size of the active site in proteases. i. Papain, Biochem. Biophys. res. commun. 27, 157 – 162. 5 • Feder, J. und Garrett, L. r. (1971) A rapid method for removal of zinc from the metallo neutral proteases, Biochem. Biophys. res. commun. 43, 943 – 948. • invitrogen, handbook - Guide to Fluorescent Probes and Labeling technologies (http://probes.invitrogen.com/ handbook/). 7 • Zou, J., Zhang, r., Zhu, F., Liu, J., Madison, V. und umland, s. P. (2005) ADAM33 enzyme properties and substrate specificity, Biochemistry 44, 4247 – 4256. • ermolieff, J., Loy, J. A., Koelsch, G. und tang, J. (2000) Pro- teolytic activation of recombinant pro-memapsin 2 (pro- beta-secretase) studied with new fluorogenic substrates, Biochemistry 39, 12450 – 12456. 5
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