Querschnitt 21 / Februar 2007 - h_da: Hochschule Darmstadt

Querschnitt 21
60000
50000
40000
30000
20000
10000
RFU
0 2000 4000 6000 8000 10000
12000
Zeit (s)
Abbildung 4b • Messung des Sauerstoffverbrauchs von Escherichia coli unter Einfluss von DMSO in folgender Konzentration:
0,01 ( ) 0,05 ( ) 0,1 ( ) 0,5 ( ) 1 ( ) und 1,5 ( ) % (v/v). Die Zellkonzentration betrug 0,48 x 10 7 Zellen pro Kavität. Angabe in relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU).
erklärt sich durch langsam durch die Paraffinschicht nachdiffundieren
den Luftsauerstoff. Des Weiteren zeigt sich eine
starke Verzögerung im Sauerstoffverbrauch aller mit DMSO
behandelten Kulturen im Gegensatz zur Kontrolle. Die Stärke
der Verzögerung ist aber nicht abhängig von der Konzentration.
Penicillin zeigt in niedrigen Konzentrationen unter 100
µM Merkmale eines Bakteriostatikums. Die Fluoreszenz zeigt
ähnlich hohe Werte wie die Kontrolle und der Sauerstoffverbrauch
erfolgt leicht verzögert. Ab einer Konzentration von
0,5 mM fällt jedoch der maximale Signalwert ab. Hier machen
sich die Destabilisierung der Zellmembran und die dadurch
erfolgte Zelllyse bemerkbar.
5 • Vergleich mit anderen methoden
Traditionell werden Sauerstoffmessungen mittels der Clarkelektrode
durchgeführt. Diese verbraucht Sauerstoff nach folgender
elektrochemischer reaktion:
pt-kathode o + e - + h + h o
ag-anode ag + cl - agcl + e -
Bei dieser reaktion kann ein Strom gemessen werden, der der
Sauerstoffkonzentration proportional ist. Clark-elektroden haben
einige systembedingte Nachteile:
Da diese reaktion Sauerstoff verbraucht, würde das Messergebnis
in den hier benötigten kleinen Volumina verfälscht
werden. Durch den hohen apparativen Aufwand sind nur sequentielle
Messungen möglich, was die Methode für Hochdurchsatz-Substanztestungen
ungeeignet macht. Da es sich
um eine invasive Messung handelt, kann die elektrode durch
0
die im zu messenden Medium enthaltenen Stoffe, wie z. B. H 2 S,
vergiftet werden. um repräsentative Messwerte zu erhalten, ist
es zudem notwendig, die elektrode in definierter Weise anzuströmen.
Außerdem können im Medium enthaltene Feststoffe
die elektrode verstopfen und so die Messung verfälschen. ein
Problem das beispielsweise in Kläranlagen auftritt.
Der fluoreszenzbasierte Sauerstoffsensor bietet aber nicht nur
im Vergleich mit klassischen Methoden der Sauerstoffmessung,
sondern gerade auch im Hinblick auf die Messung der
antimikrobiellen Aktivität Vorteile. Zur Messung der antimikrobiellen
Aktivität von Wirkstoffen, wie z. B. Antibiotika, wird üblicherweise
die so genannte minimale Hemmkonzentration mit
der „tube dilution technique“ bestimmt [1]. Dazu wird Medium
mit unterschiedlichen Antibiotikakonzentrationen in eine reihe
von reagenzgläsern gegeben und mit einer Bakterienkultur
angeimpft. Die Kulturen werden über Nacht inkubiert und die
reagenzgläser in denen kein Wachstum auftritt erfasst und so
die Minimale Hemmkonzentration (MHK) bestimmt.
eine alternative Methode zur Bestimmung antimikrobieller Aktivität
ist die so genannte „agar diffusion method“ [1]. Dazu wird
ein Agar-Nährboden gleichmäßig mit der Testkultur inokuliert.
Auf Filterpapierscheiben werden definierte Mengen des Antibiotikums
aufgegeben und die Papiere werden auf die Agar-
oberfläche gelegt. Die Agarplatten werden inkubiert. Währenddessen
diffundiert das Antibiotikum in den Agar. Je weiter
es diffundiert, desto geringer ist seine Konzentration an dieser
Stelle. Dabei wird an einer Stelle die MHK erreicht. Oberhalb
dieser Konzentration wird das Wachstum der Mikroorganismen
gehemmt. Nach der MHK wachsen die Mikroorganismen weiterhin.
Nach der Inkubationszeit kann man so Hemmhöfe um
Verwendung fluoreszenzbasierter sauerstoffsensoren zur unterscheidung bakterizider und bakteriostatischer substanzen
das Filterpapier erkennen, in denen kein Wachstum stattfand.
Deren Durchmesser ist proportional zur aufgegebenen Antibiotikamenge.
Beide Methoden zur Bestimmung der antimikrobiellen
Aktivität erfordern lange Inkubationszeiten, meist über
Nacht. Außerdem können durch den erforderlichen Aufwand
nur wenige Proben auf einmal gemessen werden.
Die hier vorgestellten fluoreszenzbasierten Sensoren sind
im Gegensatz zu Clark-elektroden auch in kleinen Volumina
einsetzbar und so insbesondere zur Messung des Sauerstoff-
Verbrauchs von Bakterien geeignet. Sie können nicht-invasiv
eingesetzt werden, somit ist die Messung unabhängig von der
Zusammensetzung des Mediums. Im Gegensatz zu etablierten
Methoden zur Bestimmung der Wirksamkeit von Antibiotika,
ermöglichen die fluoreszenzbasierten Sensoren in Mikrotestplatten
die Bestimmung von Dosiswirkungskurven von Wirkstoffen
in erheblich kürzerer Zeit. Außerdem kann ein sehr
hoher Probendurchsatz erreicht werden, weil bis zu 96 Proben
parallel bestimmt werden können. Möglicherweise lässt sich
der Sensor auch auf 384-Mikrotestplatten etablieren, was in
Kombination mit automatischen Pipettierstationen den Durchsatz
weiter erhöhen würde.
6 • Fazit und Ausblick
In diesem Bericht wird die Herstellung, Qualitätskontrolle und
Verwendung eines fluoreszenzbasierten Sensors zur untersuchung
des Sauerstoff-Verbrauchs von Bakterienkulturen
beschrieben. Der steigende einsatz von Tests mit pro- oder eukaryontischen
Zellen, fordert immer effizientere und kostengünstigere
Assays, mit denen Bakterienkulturen untersucht
werden können. Die Verwendung fluoreszenzbasierter Sensoren
kann diese Anforderungen erfüllen. So ist die Herstellung
der Sensoren einfach und kostengünstig. Ferner konnten die
Wirkungen von Antibiotika nachgewiesen werden. es konnte
darüber hinaus gezeigt werden, dass sich bakteriostatisch und
bakterizid wirksame Antibiotika durch 3 – 4-stündige Sauerstoffverbrauchs-Kinetiken
unterscheiden lassen. Damit könnten
nicht nur individuelle Antibiogramme von Patienten noch
schneller als mit herkömmlichen Methoden erstellt werden,
sondern auch neue Antibiotika hinsichtlich ihres Wirkmechanismus
charakterisiert werden. Aber auch viele andere Sub-
stanzen können auf ihre Toxizität hin untersucht werden. Vorstellbar
ist auch, Atmungsgifte in ihren effekten durch den
Sensor voneinander zu unterscheiden. Die einfache Herstellung
und Benutzung machen den Sensor für viele Bereiche, in
denen Sauerstoff gemessen wird, attraktiv. eine Anwendung
könnte das Monitoring des Sauerstoffgehalts einer Fermentationslösung
in einem Bioreaktor darstellen.
Hierbei ist gerade von Bedeutung, dass der Sensor nicht invasiv
eingesetzt werden muss, wie die Clark-elektrode. Dieser
Vorteil macht den Sensor auch für die Anwendung in Kläranlagen
interessant. Auch in Biogasanlagen wäre ein einsatz des
Sensors möglich. Hier ist es notwendig, den restsauerstoff im
Gasgemisch unter 2 – 3 % zu halten, da zum einen der Brennwert
des Gases sonst zu niedrig ist. Zum anderen reagiert der
bei der reaktion anfallende Schwefelwasserstoff mit Sauerstoff
zu Schwefelsäure. Der Sensor bietet den Vorteil, dass er
gerade bei niedrigen Sauerstoffkonzentrationen sensitiv ist,
außerdem kann er im Gegensatz zur Clark-elektrode nicht
durch Schwefelwasserstoff vergiftet werden.
Der Sensor kann weiterhin nicht nur für Toxizitätstest mit Mikroorganismen
eingesetzt werden, sondern auch für Tests mit
80000
60000
40000
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Abbildung 5a • Clindamycin
80000
60000
40000
20000
RFU
0
0,0001 0,001 0,01 0,1 1
Abbildung 5b • Penicillin
80000
60000
40000
20000
RFU
RFU
FAchbereich chemie und biotechnologie
0
0,1 1 10
c(Clindamycin) [mM]
c(Penicillin) [mM]
0
0,001 0,01 0,1 1 10
c(DMSO) [% (v/v)]
Abbildung 5c • DMSO
Abbildungen 5: Maximales Fluoreszenzsignal | Messung des Sauerstoffverbrauchs
von Escherichia Coli unter einfluss von (a) Clindamycin, (b) Penicillin und
(c) DMSO. Die Zellkonzentration betrug 0,48 x 107 Zellen pro Kavität. rFu gibt die
maximale Fluoreszenzintensität der Sauerstoff-Verbrauchskurven in relativen
einheiten an.
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