Medicina.forense.Grandini.3ª.Ed

Genética forense 209
Reacción en cadena
de la polimerasa (PCR)
La PCR ha sido sin duda alguna una de las técnicas que más ha revolucionado la investigación
científica y conferido un gran soporte a la genética forense. Esta reacción permite
amplificar in vitro de forma selectiva más de un millón de veces una molécula específica
de DNA presente en un DNA aislado de una muestra de sangre, orina, pelo con folículo
o raspado de células, entre otros. Es una técnica rápida, sencilla y relativamente barata
cuyos componentes son el DNA templado (proveniente en este caso del vestigio biológico),
oligonucleótidos, enzima DNA polimerasa que es la encargada de sintetizar las nuevas
cadenas de DNA, desoxirribonucleótidos trifosfatos (dNTP), amortiguador de reacción,
MgCl 2 y agua. La reacción se realiza en tres pasos:
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• Desnaturalización: en este punto, el DNA templado se expone a una temperatura de 95ºC alrededor
de 5 min y luego en cada ciclo durante 1 min. Esta elevación de la temperatura genera
la separación temporal, pero suficiente, de la doble cadena de DNA debido al rompimiento
de los puentes de hidrógeno que las unen. De esta forma se crea un DNA templado de una
sola cadena, tal y como lo necesita la DNA polimerasa (figura 13-7).
• Hibridación: se realiza a la temperatura previamente calculada y promedio (40 a 65ºC), en la
cual los oligonucleótidos seleccionados son capaces de unirse (o hibridar) de modo específico
con su secuencia complementaria en los extremos flanqueadores del DNA que se requiere
amplificar en cada hebra. Este paso puede tener una duración de 30 seg hasta 2 min (figura
13-7).
• Extensión: en este paso, la DNA polimerasa realiza la síntesis de las nuevas cadenas de DNA,
en las que a partir del extremo 3’OH del oligonucleótido la enzima incorpora los nuevos
nucleótidos y la cadena de DNA molde funciona como templado. Este paso se efectúa a una
temperatura de 72ºC, ya que aquí la DNA polimerasa presenta su máxima actividad de polimerización.
De forma óptima, la enzima es capaz de sintetizar en 1 min 1kb de DNA, por
lo que el tiempo de este paso depende en gran medida del tamaño del fragmento de DNA a
amplificar, pero casi siempre oscila entre 30 seg y 1 min.
Estos tres pasos constituyen un ciclo, que debe repetirse “n” número de veces, de acuerdo
con el tamaño y la cantidad de DNA que se desea amplificar. Por lo tanto, en el primer
ciclo de la PCR se cuenta con dos cadenas de DNA templado y se sintetizan dos nuevas
cadenas; en el siguiente ciclo se tienen cuatro cadenas de DNA templado y se sintetizan
cuatro nuevas cadenas. Es decir, la cantidad de DNA se duplica con cada ciclo de PCR
(figura 13-7). Esta reacción se efectúa en un termociclador que automáticamente lleva a
cabo los cambios de temperaturas de acuerdo con los ciclos marcados en su programa. Los
productos obtenidos de la reacción de PCR se separan mediante electroforesis y se analizan.
Mediante esta técnica es posible amplificar de forma rápida, específica y reproducible los
DNA microsatélites de las diferentes muestras biológicas obtenidas en un caso, además de
establecer relaciones de parentesco entre individuos (Welch, 2012).