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IL MECCANISMO DI TRASFERIMENTO DEL DNA DURANTE LA CONIUGAZIONE L’intera serie di eventi scatta con il contatto tra cellula e cellula: in quel momento un filamento del DNA circolare del plasmide viene tagliato e un filamento parentale viene trasferito. Non appena inizia il trasferimento di DNA, nel donatore mediante il meccanismo a cerchio rotante si ha la sintesi del DNA che porterà alla sostituzione del filamento del DNA trasferito. Un filamento di DNA complementare viene sintetizzato anche nel ricevente. Perciò, alla fine del processo, sia il donatore che il ricevente possiedono un plasmide intero. Il processo di trasferimento del DNA plasmidico è altamente efficiente; se i geni del plasmide possono essere espressi nel ricevente, lo stesso ricevente diviene donatore e può trasferire il plasmide a un altro ricevente. In tal modo i plasmidi coniugativi possono diffondersi rapidamente tra popolazioni, comportandosi da agenti infettivi. 38
Il plasmide F di E.coli può mobilizzare il cromosoma e trasferirlo durante il contatto cellulacellula. Il plasmide F è un episoma, ovvero un plasmide che può integrarsi nel cromosoma dell’ospite. Se il plasmide F è integrato nel cromosoma , la coniugazione può dar luogo al trasferimento di una larga regione del cromosoma ospite che potrà determinare ricombinazione genetica tra ampie regioni del cromosoma del donatore e del ricevente. Le cellule che possiedono il plasmide F non integrato sono dette F + e quelle che hanno il plasmide integrato nel cromosoma sono dette Hfr. Le cellule senza plasmide F sono dette F - e agiscono da riceventi. La presenza del plasmide F porta a tre cambiamenti nelle proprietà della cellula: - capacità di sintetizzare il pilo F - mobilizzazione del DNA per il trasferimento in un’altra cellula - alterazione dei recettori di superficie in modo che la cellula non sia più in grado di comportarsi come un ricevente nella coniugazione L’integrazione del plasmide F in un cromosoma ospite può avvenire in vari siti specifici, detti IS (sequenza di inserzione), che costituiscono regioni di omologia tra il cromosoma e il plasmide F. Di solito, poiché durante il trasferimento si ha facilmente la rottura del pilo, e di conseguenza del filamento di DNA, solo una parte del cromosoma del donatore viene trasferito, per cui non si può replicare nella cellula ricevente. Pertanto i geni presenti sul cromosoma del donatore sono identificabili solo se avviene ricombinazione tra la porzione del cromosoma del donatore che è entrata e il cromosoma della cellula ricevente. Sebbene i ceppi Hfr trasmettono geni cromosomali ad alta frequenza, essi non convertono le cellule F - in cellule F + in quanto solo raramente viene trasferito l’intero plasmide F. D’altro lato le cellule F + convertono in modo efficiente F - in F + proprio perché viene trasferito l’intero plasmide F. Quindi affinché un ceppo possa diventare F + o HFR deve penetrare tutto il plasmide. Poiché negli Hfr normalmente l’episoma non entra quasi mai (perché, mentre entra il cromosoma batterico linearizzato, spesso si spezza il pilo lasciando fuori il plasmide), normalmente si lavora con plasmidi non integrati e successivamente si fanno integrare artificialmente. Occasionalmente i plasmidi F integrati possono escindersi dal cromosoma e durante questo processo essere inseriti dei geni cromosomici all’interno del plasmide F libero, questo fenomeno può avvenire in quanto il plasmide integrato e il cromosoma contengono un certo numero di sequenze identiche tra le quali può avvenire la ricombinazione. I plasmidi F contenenti geni cromosomici sono detti plasmidi F ’ . I plasmidi sono diventati strumenti indispensabili per la biologia molecolare e per lo studio genetico dei microrganismi perché: • Sono molto piccoli ed è conosciuta la loro costituzione genetica. Quindi si sa dove poter inserire il/i gene/i che vogliamo trasferire. (gli enzimi di restrizione tagliano in determinati siti e le ligasi si occupano dell’inserimento). • Sono caratterizzati da facilità di moltiplicazione autonoma, quindi si può amplificare molte volte il gene che voglio trasferire. • Sono facili da trasmettere ad un eventuale ospite, dove può avvenire l’amplificazione. Anche nello studio dei lieviti per avere un gene per un dato carattere, è possibile comprare un plasmide in cui è inserito il gene che interessa. Il plasmide è un vettore di clonaggio. L’E. coli (ospite del plasmide) è importante perché è il batterio più conosciuto (genoma noto) ed è facilmente coltivabile perché si adatta bene in terreni diversi. 39
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