com as técnicas de FISH, CMA, DAPI - IAC

3.2 Métodos
3.2.1 Germinação de sementes
Sementes foram colocadas para germinar em placas de Petri com papel de filtro
umedecido com água destilada. As placas foram mantidas à temperatura ambiente, em
fotoperíodo de 8 horas sob luz incandescente e fluorescente simultaneamente.
Após um período de aproximadamente dois a três meses, as raízes com
comprimento de 3 mm (aproximadamente igual ao diâmetro da semente) foram
coletadas e pré-tratadas com anti-mitótico.
3.2.2 Pré-tratamento de raízes e fixação
O pré-tratamento das raízes, para se obter maior quantidade de células na fase de
metáfase, foi realizado com o anti-mitótico para-diclorobenzeno (PDB) (solução
saturada) por 9 horas à temperatura de 15ºC.
Após o pré-tratamento, as raízes foram fixadas em Carnoy (solução de álcool
etílico e ácido acético, na proporção 3:1) sendo o material, neste estágio, submetido ao
vácuo durante 3 minutos. Em seguida à fixação, o material permaneceu durante 24
horas à temperatura ambiente. Após as 24 horas, o fixador foi trocado e o material
transferido para geladeira (4 –5ºC) onde permaneceu também por mais 24 horas. Em
seguida, foi armazenado em freezer (-18ºC) até a sua utilização nas preparações
citológicas.
3.2.3 Hidrólise e preparações citológicas
Para as preparações citológicas, as pontas das raízes já fixadas e armazenadas no
freezer, foram lavadas com água destilada e na sequência, em tampão citrato (citrato
trissódico-hidratado mais ácido cítrico-monohidratado, pH 4.5). Em seguida, para o
amolecimento do meristema, as raízes foram hidrolisadas em solução enzimática (0,2%
celulase, 0,2% citohelicase, 0,2% pectoliase diluídas em 2 mM de tampão citríco-citrato
pH 4,5) à 37ºC em banho maria por 30 a 40 minutos. Após a hidrólise das raízes, foram
montadas as preparações citológicas, isolando-se o tecido meristemático diretamente
numa lâmina com o auxílio de um bisturi e lupa, e em seguida esmagando-o em ácido
acético 45%. O material foi coberto com lamínula, a lâmina foi aquecida em chama, e o
esmagamento completado pressionando-se a preparação aquecida entre duas folhas de
papel filtro para retirar o excesso de ácido acético e promover o espalhamento dos
cromossomos. Em seguida, as preparações foram analisadas em microscópio com
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