com as técnicas de FISH, CMA, DAPI - IAC

microscópio com filtro específico para o fluorocromo DAPI e as imagens documentadas
conforme item 3.2.4.
3.2.8 Bandamento com nitrato de prata - AgNOR
Para o bandamento com nitrato de prata, seguiu-se o protocolo de HOWELL &
BLACK (1980). As lâminas armazenadas em geladeira foram transferidas e mantidas
em temperatura ambiente até secarem.
Nas preparações citológicas foram colocadas duas soluções sendo a primeira
delas composta de 0,02 g/ml de gelatina e 0,01 ml de ácido fórmico diluído em água e a
segunda composta por 0,5 g/ml de nitrato de prata dissolvido em água. Essas soluções
foram colocadas sequencialmente e na proporção de 1: 2 respectivamente.
As lâminas foram cobertas com lamínulas 24 X 40 mm e incubadas na estufa a
70°C por um tempo variando de 3 a 4 minutos. A determinação do tempo ideal de
coloração foi realizada monitorando-se, ao microscópio, as lâminas submetidas a
diferentes tempos de incubação. Quanto maior o tempo de incubação maior a oxidação
da prata e escurecimento da coloração.
Após a incubação as lâminas foram lavadas com água deionizada e deixadas em
temperatura ambiente para secar. Depois de secas, foram montadas com meio de
montagem Permount, analisadas em microscopia de fase e as imagens registradas
conforme descrito no item 3.2.4.
3.2.9 Hibridação in situ fluorescente
3.2.9.1 Sondas
Para a hibridação in situ, foram usadas duas sondas de rDNA; a pTa71 que
corresponde à sequência de DNA ribossômico de Triticum aestivum, que abrange as
regiões 18S, 5.8S e 26S, com 9,0 Kb (GERLACK & BEDBROOK, 1979) clonada no
plasmídeo pUC19. E a sonda pScT7 correspondente à sequência de DNA ribossômico
5S isolado de Secalle cereale com 300-500 pb (LAWRENCE & APPELS, 1986)
clonada no plasmídeo pUC8.
3.2.9.2 Hibridação molecular in situ de sondas de DNA ribossomais de 45S e 5S
Para a técnica de hibridação in situ fluorescente foi utilizado o protocolo descrito
por PENDAS et al. (1993) e modificado por PINTO-MAGLIO et al. (2000). Este
protocolo consta das seguintes etapas:
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