com as técnicas de FISH, CMA, DAPI - IAC

condensador de contraste de fase. As preparações que apresentavam grande número de
células na fase de metáfase foram selecionadas e imersas rapidamente em nitrogênio
líquido para a retirada das lamínulas. Após a retirada da lamínula, as lâminas
permaneceram secando em temperatura ambiente durante um dia e após este período,
foram armazenadas na geladeira até serem utilizadas para as diferentes técnicas.
3.2.4 Microscopia e análise das imagens
Todas as preparações citológicas deste estudo foram analisadas em um
microscópio Olympus BX50 com acessório para epifluorescência e câmera digital
refrigerada Olympus Q-Color 3.
Para as lâminas com as técnicas de bandamento fluorescente e com a técnica de
hibridação in situ usaram-se os seguintes filtros: U-MWU para DAPI (AZUL/UV –
excitação a 330/385 nm e emissão a 420 nm), U-MWBV para CROMOMICINA
(VERDE/UV – excitação a 400/440 nm e emissão a 475 nm) e U-MNB2 para FITC
(VERDE/UV – excitação a 450 nm e emissão a 570 nm) para os sinais de fluoresceína
na hibridação in situ. Para as análises das lâminas sem coloração, as coradas com
corante Giemsa e as impregnadas pela prata, usou-se o mesmo microscópio com o
condensador para contraste de fase.
As imagens foram capturadas através de um sistema de análise de imagens
computadorizado e com o software Image-ProPlus versão 6.0 (Media Cybernetics, Inc,
Silver Spring, MD, USA).
3.2.5 Coloração com Giemsa
Para a coloração com Giemsa, as lâminas preparadas e armazenadas conforme
item 3.2.3, foram retiradas da geladeira e mantidas em suporte até ficarem
completamente secas.
Após a secagem, as lâminas foram colocadas em uma cuba contendo Giemsa 2%
(98 ml de água e 2 ml de Giemsa) e mantidas por 3 minutos. O tempo ideal de coloração
foi estabelecido monitorando-se, ao microscópio, as lâminas submetidas a diferentes
tempos de coloração com Giemsa.
Após os 3 minutos as lâminas foram lavadas com água destilada e mantidas em
temperatura ambiente para secarem. Após a secagem foram montadas com Permount.
Em seguida as lâminas foram analisadas conforme descrito no item 3.2.4.
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