Multiple Defekte der Hämatopoese und T ... - bei DuEPublico

wurde durch Zentrifugation zunächst das DMSO-haltige Einfriermedium abgetrennt und die
Zellen in frischem Medium aufgenommen.
Einfriermedium 50 % vollständiges Medium
40 % FBS
10 % DMSO
5.6.7 Isolation von T-Lymphozyten aus Organen
5.7.7.1 Herstellen einer Einzelzellsuspension
Bei den Versuchen mit primären T-Zellen war es notwendig, zunächst die Zellen in
Suspension zu bringen. Dazu wurden die entsprechenden Organe den Mäusen entnommen und
zwischen zwei geschliffenen Objektträgern in kaltem PBS/1% FBS zerrieben. Zur Abtrennung
von Organresten wurden die Zellen über mit Baumwolle gestopfte Pasteurpipetten filtriert.
Nach 5 minütiger Zentrifugation bei 1000 Upm wurden die Zellen in Medium aufgenommen.
Die Bestimmung der Zellzahl erfolgte stets mit dem Zellzählgerät CASY-1 (Fa. Schärfe).
5.6.7.2 Erythrozytenlyse
Vor der weiteren Aufreinigung von T-Zellen besonders aus der Milz war es z.T. notwendig die
Erythrozyten zu lysieren. Dazu wurden abzentrifugierte Zellen jeweils einer Milz in 1 ml 1x
Ammoniumchlorid-Lysispuffer (Fa. Pharmingen) aufgenommen und für 5 min bei RT
inkubiert. Anschließend wurden 10 ml vollständiges Medium hinzugegeben, um die
Lysisreaktion zu stoppen. Nach erneuter Zentrifugation konnten die Zellen zur weiteren
Verwendung in Medium oder PBS aufgenommen werden.
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