Multiple Defekte der Hämatopoese und T ... - bei DuEPublico

5.8.5 CFSE-Färbung (Wells et al., 1997)
Die Bestimmung der Mitoserate durch Carboxyfluorescein-succinimidylester (CFSE) beruht
auf dem Prinzip, daß der Fluoreszenzfarbstoff sich bei der Teilung von Zellen auf beide
Tochterzellen gleichmäßig verteilt und sich damit auch die Intensität des Farbstoffs halbiert.
Einzelzellsuspensionen von Milz oder Lymphknoten wurden nach Erythrozytenlyse (s.
5.6.5.2) in 5 ml PBS aufgenommen und für 5 min mit 2,5 µl CFSE-Lösung (Fa. Molecular
Probes; 10 mM in DMSO) bei RT inkubiert. Anschließend wurde überschüssiges CFSE durch
Zugabe von 10 ml MTC-Medium inaktiviert und Zellen wie beschrieben stimuliert und
kultiviert. Zur Analyse wurden die Zellen nach den angegebenen Zeitpunkten geerntet und mit
Thy1-PE Antikörpern gefärbt, um T-Zellen elektronisch auswählen zu können (s. 5.8.1). Nach
Auswahl lebender, Thy1 + Zellen wurden 20.000 Signale aufgenommen und deren CFSE-
Intensität als Histogramm dargestellt.
5.8.6 Detektion apototischer Zellen über AnnexinV
Die Analyse apoptotischer Zellen erfolgte unter Verwendung des „Apoptosis Detection Kit“
der Fa. Pharmingen nach Protokoll des Herstellers. Sollte die AnnexinV Anfärbbarkeit
einzelner Populationen differenziert dargestellt werden, wurde auf die Inkubation mit PI
verzichtet und stattdessen PE- oder TriColor-gekoppelte Antikörper eingesetzt und die Zellen
zusätzlich einmal mit CellWash gewaschen.
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