Multiple Defekte der Hämatopoese und T ... - bei DuEPublico

5.2 Bakterien
5.2.1 Verwendeter Bakterienstamm
DH5α: supE44, hsdR17, recA, ΔlacU169, (ϕ80lacΖΔΜ15), endA1, gyrA96, thi-1, relA1
Langsam wachsender recA - Stamm, der sich für die Transformation und die
Vermehrung von Plasmiden eignet.
5.2.2 Kultivierung von Bakterien
Bakterien wurden in LB-Medium, dem gegebenenfalls Ampicillin als Antibiotikum zugesetzt
wurde, bei 37˚C kultiviert. Alle LB-Medien wurden autoklaviert und das Antibiotikum nach
Abkühlen auf 50 °C zugegeben.
LB-Medium 20 g/l LB Broth Base (Fa. Sigma)
pH 7,2 einstellen
5.2.3 Herstellung transformationskompetenter Bakterien
Zur Herstellung transformationskompetenter DH5α-Bakterien wurden 300 ml LB-Medium
mit 1 ml einer Übernachtkultur angeimpft und bei 37˚C bis zu einer OD 600 = 0,5
(logarithmische Wachstumsphase) im Schüttler wachsen gelassen. Nach 20 minütiger
Inkubation auf Eis wurden die Bakterien bei 4˚C und 2.500 Upm abzentrifugiert, der
Überstand verworfen und die Bakterienpellets in jeweils 25 ml eiskalter 0,1 M CaCl2 Lösung
resuspendiert. Nach einstündiger Inkubation auf Eis wurden die Bakterien erneut
abzentrifugiert und die Sedimente in insgesamt 12 ml eiskalter 0,1 M CaCl2 Lösung
resuspendiert und vereinigt. Nach einer weiteren Inkubationsperiode von 2 h auf Eis, wurde 4
ml Glycerin hinzugegeben, die Bakteriensuspension zu 400 µl aliquotiert und bei -80˚C
gelagert.
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