Multiple Defekte der Hämatopoese und T ... - bei DuEPublico

mitogenen Substanz in PBS für 1 h bei 37°C inkubiert. Die im Ergebnisteil angegeben
Konzentrationen beziehen sich immer auf die Endkonzentration des Mitogens.
5.6.10 Bestimmung der Proliferationsrate durch Thymidineinbau
Zur Vorbereitung des Versuches wurden 96-Lochplatten mit verschiedenen mitogenen
Substanzen beschichtet (s. 5.6.9). Alle Versuche fanden mit aufgereinigten T-Zellen der Milz
(s. Kapitel 5.6.7) in Dreifachbestimmung statt. Die T-Zellen wurden mit einer Konzentration
von 40.000 Zellen / 180 µl MTC-Medium und Vertiefung ausplattiert. 8 h vor den
angegebenen Zeitpunkten wurde 1 µCi 3 H -Thymidin pro Vertiefung in 10 µl MTC-Medium
hinzugegeben, diese für 8 h inkubiert und die Zellen mit einem Cell Harvester (Fa. Wallac)
geerntet, wobei die DNA der Zellen mit dem eingebauten radioaktivem 3 H -Thymidin auf
Filterpapier immobilisiert wurde. Diese Filter wurden getrocknet und zusammen mit 10 ml
Beta Plate Scint Szintillationsflüssigkeit (Fa. Wallac) in Plastikfolie eingeschweißt. Die
Auswertung erfolgte durch Bestimmung der Ereignisse pro Minite mit Hilfe eines β-Plate
Reader Szintillationszähler (Fa. Wallac).
5.6.11 FTOC
Trächtige Mäuse aus Gfi-1 +/- Verpaarungen wurden am Tag 13 post coitum getötet, die
Embryonen isoliert und deren Thymusanlagen präpariert. Zuvor wurden Isopore Membran
Filter (0,8 µm ATTP; Fa. Millipore) für 1 h auf der Oberfläche des FTOC-Mediums
präinkubiert und anschließend die Thymi auf diese Filter gesetzt. Die Inkubation erfolgte bei 5
% CO 2 und alle zwei Tage wurden die Filter samt Thymi auf die Oberfläche von frischem
Medium gesetzt.
FTOC-Medium 95 % (v/v) Medium-199
5 % (v/v) FBS
1000 U Penicillin / Streptomycin
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