Multiple Defekte der Hämatopoese und T ... - bei DuEPublico

eine Färbung mit Thy1 und B220 durchflußzytometrisch überprüft und lag durchschnittlich
zwischen 80-95 %. Zur Stimulation der T-Zellen wurden verschiedene Konzentrationen anti-
CD3 Antikörper, ConcanavalinA, PMA und Staphylokokken Enterotoxin B eingesetzt. Nach
24, 48 und 72 h in Kultur wurde pro Vertiefung 1 µCi 3 H-Thymidin zugegeben, die Zellen
nach 8-stündiger Inkubation geerntet und der Thymidineinbau als Maß für die Proliferation
gemessen (5.6.9). Abbildung 32 zeigt einige dieser Ergebnisse als Einzelwert nach 72 h oder
über die Zeit aufgetragen. Es wird ersichtlich, daß die T-Zellen aus den Gfi-1-defizienten
Tieren nach Stimulation deutlich schlechter proliferieren als die Zellen der wt Kontrolle. Dieser
Effekt scheint unabhängig von der Art des Stimulus zu sein. Es fiel lediglich auf, daß besonders
bei hohen Konzentrationen an anti-CD3 Antikörper als Stimulus die Unterschiede geringer
wurden (Daten nicht gezeigt).
a b
400000
300000
200000
100000
0
72 h 1 µg/ml α-CD3
Abb. 32: Bestimmung der Proliferationsrate durch Thymidineinbau
+/+
-/-
T-Zellen der Milz aus Gfi-1 +/+ und Gfi-1 -/- Tieren wurden über Affinitätssäulen aufgereinigt, mit einer Dichte von
40.000 Zellen / Vertiefung in einer 96-Lochplatte ausgesät und mit verschiedenen Reagenzien stimuliert. Nach
den angegebenen Zeitpunkten wurde für 8 h 1 µCi 3 H-Thymidin zugegeben, die Zellen geerntet und der Einbau
an radioaktivemThymidin bestimmt. Angegeben sind immer die Mittelwerte einer Dreifachbestimmung mit
Standardfehlerabweichung a: Vergleich der Thymidininkorporation nach 72 h von wt und Gfi-1-defizienten
Mäusen: (1) unstimuliert, (2) 0,1 µg/ml α-CD3, (3) 2 µg/ml α-CD3, (4) 0,1 µg/ml ConcanavalinA, (5)
0,1 µg/ml α-CD3 + 10 ng/ml IL-2, (6) 0,1 µg/ml ConcanavalinA + 10 ng/ml IL-2. Es zeigt sich, daß
unabhängig von der Art und Konzentration des Stimulus die Proliferationsrate von T-Zellen durch den Gfi-1
Verlust verringert ist. Dieser Effekt kann auch durch die exogene Zugabe von Interleukin-2 nicht aufgehoben
werden. b: Zeitlicher Verlauf der Stimulation mit 1 µg/ml α-CD3 über 72 h. Auch hier zeigt sich eine deutliche
Verringerung der Thymidininkorporation beim Gfi-1 -/- Tier jedoch offensichtlich erst nach längerer Zeit.
Ergänzend zum Thymidineinbau wurde eine CFSE-Färbung durchgeführt, mit deren Hilfe die
Anzahl mitotischer Teilungen bestimmt werden kann. Hierzu wurden entweder vollständige
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400000
300000
200000
100000
0
1 2 3 4 5 6 0 24 48 72 [h]
+/+
-/-