Interaktion von Masernviren mit Dendritischen Zellen - OPUS ...

Methoden 64
3.6 Molekularbiologische Methoden
3.6.1 RNA-Präparation
Die Präparation von Gesamt-RNA aus DC wurde gemäß der Anleitung des
RNeasy-Mini® Kits durchgeführt. Die Menge der gewonnenen RNA wurde
photometrisch (OD260) bestimmt und bis zur Verwendung bei −80° C gelagert.
3.6.2 Reverse Transkription
Die Reverse Transkriptase ist eine RNA-abhängige DNA-Polymerase. Bei einer
Reversen Transkription wird mit Hilfe dieses Enzyms einzelsträngige RNA in
cDNA umgeschrieben. Weiterhin besitzt dieses Enzym eine RNase H Aktivität,
die spezifisch RNA in RNA/DNA Hybriden degradiert.
Für eine Reverse Transkription wurde 1 Mikrogramm der isolierten RNA
eingesetzt. Das Volumen wurde mit Hilfe von RNase freiem Wasser auf 12 bzw.
13 Mikroliter eingestellt. Nach der Zugabe von jeweils 1 Mikroliter Oligo dT-
(und Random-Primern) (500 µg/ml) wurde die RNA für 10 Minuten bei 70° C
denaturiert und anschließend kurz abzentrifugiert. Nach der Zugabe von jeweils
2 Mikroliter 10 x RT-Puffer und dNTP-Mix sowie RNase-Inhibitor (10 U/µl)
wurde der Ansatz für 2 Minuten bei 37° C inkubiert und kurz abzentrifugiert. Vor
der zweistündigen Inkubation bei 37° C wurde 1 Mikr oliter Reverse
Transkriptase (4 Units/µl) zum Ansatz pipettiert. Die gewonnene cDNA wurde
entweder direkt in eine Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction,
PCR) eingesetzt oder bei −80° C gelagert.