Metabolomanalyse zur Untersuchung der Dynamik im ...

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6.3. Einsatz der 1 H–NMR Metabolit Analytik für die E. coli L–Phe Stammentwicklung L-Phe [mM] 250 200 150 100 50 L-Phe DAH(P) DHS SHI 0 0 10 20 30 40 50 Zeit [h] 100 80 60 40 20 0 DAH(P), DHS, SHI [mM] PEP + E4P DAHP aroF aroB DHQ aroD DHS aroE SHIK aroK / L S3P aroA EPSP aroC Chorismat pheA Prephenat pheA Phenylpyruvat tyrB L-Phe aroK / L aroF fbr pheA fbr Abbildung 6.15.: 1 H–NMRDaten der Fermentation mit E. coli 4pF20 (links), Nebenproduktachse ist 2,5-fach überhöht dargestellt, L–Phe Biosynthese mit Genen bzw. gentechnischen Veränderungen (rechts), limitierende Gene weiß auf schwarz dargestellt L-Phe [mM] 250 200 150 100 50 L-Phe DAH(P) 0 0 10 20 30 40 50 Zeit [h] 100 80 60 40 20 0 DAH(P) [mM] PEP + E4P DAHP aroF aroB DHQ aroD DHS aroE SHIK aroK / L S3P aroA EPSP aroC Chorismat pheA Prephenat pheA Phenylpyruvat tyrB L-Phe aroF fbr aroL pheA fbr Abbildung 6.16.: 1 H–NMRDaten der Fermentation mit E. coli 4pF26 (links), Nebenproduktachse ist 2,5-fach überhöht dargestellt, L–Phe Biosynthese mit Genen bzw. gentechnischen Veränderungen (rechts), limitierende Gene weiß auf schwarz abgebildet 89
6. Ergebnisse und Diskussion Gene überexprimiert werden, als potenziell limitierende Reaktionsschritte wurden für E. coli 4pF20 AroK/L, AroB und AroE identifiziert. Die Metabolit–Bilanz für E. coli 4pF20 konnte unter Einbeziehung der gemessenen Nebenprodukte DAH(P), DHS und SHI zu 97-102% geschlossen werden. 6.3.2. E. coli 4pF26 Der Stamm E. coli 4pF26 enthält die Gene aroF fbr , pheA fbr und aroL auf dem Plasmid pF26. Ausgehend von den dargestellten Ergebnissen von E. coli 4pF20, wurde in den Stamm E. coli 4pF26 zusätzlich das Gen für die Shikimat Kinase II (aroL) auf dem Plasmid eingefügt. Die Überexpression dieses Gens sollte die Akkumulation von Shikimat verhindern und so zu einer höheren L–Phe Bildung führen. Die Ergebnisse dieses Stammes sind in Abb. 6.16 dargestellt. Die Bildung von Shikimat konnte verhindert werden, interessant ist hierbei, das auch keine Bildung von DHS mehr beobachtet wurde. Das lässt den Schluss zu, dass die intrazelluläre Konzentration von Shikimat offenbar Einfluss auf die Bildung von DHS hatte. Für die Shikimat Dehydrogenase (AroE) wird von Dell et al. [49] über eine Feedback–Inhibierung durch Shikimat berichtet. Das bedeutet, dass im Stamm 4pF26 die intrazelluläre Shikimat– Konzentration durch die Überexpression von aroL offensichtlich so stark herabgesetzt wurde, dass diese Feedback–Schleife inaktiv war und dass neben Shikimat auch kein DHS mehr gebildet wurde. DAH(P) war das einzige Nebenprodukt aus der Aromatenbiosynthese, was analog zu den Ergebnissen mit E. coli 4pF20 auf eine Limitierung durch die 3–Dehydroquinat Synthase (AroB) hindeutete [110]. Da dieser enzymatische Schritt vor DHS und Shikimat liegt, hatte die Überexpression von aroL keinen Einfluss auf die DAH(P) Bildung, die mit E. coli 4pF20 vergleichbar ist. Unter Einbeziehung von DAH(P) konnte die Metabolit–Bilanz für 4pF26 geschlossen werden. Im nächsten Schritt sollte neben aroL zusätzlich das aroB Gen überexprimiert werden, um die L–Phe Bildung weiter zu erhöhen. 6.3.3. E. coli 4pF69 Der Stamm E. coli 4pF69 enthält die Gene aroF wt , aroL und pheA fbr auf dem Plasmid pF69. Im Vergleich zu E. coli 4pF26 wurde in E. coli 4pF69 das Gen für aroF fbr gegen das Wildtypgen aroF wt ausgetauscht. Die Verwendung des natürlichen Wildtyp–Gens hatte Vorteile in Bezug auf die Stabilität und Aktivität des Enzyms. Durch prozesstechnische Regelung der L–Tyr Konzentration in der Fermentation wurde die Feedback–Inhibierung des Enzyms durch L–Tyr erfolgreich umgangen [70]. Die Ergebnisse dieses Stammes sind in Abb. 6.17 dargestellt. Analog zu E. coli 4pF26 wurde auch hier keine DHS oder Shikimat Bildung beobachtet, nur DAH(P) wurde als Nebenprodukt gemessen. Im Vergleich zu 4pF26 wurde die maximale L–Phe Konzentration hier früher erreicht, was auf eine höhere Aktivität von AroF wt hinweist. Die Bildung und die maximale Konzentration von DAH(P) waren jedoch in beiden Fällen sehr ähnlich. 6.3.4. E. coli 4pF79 Der Stamm E. coli 4pF79 enthält aroF wt , aroB und pheA fbr auf dem Plasmid pF79 und stellte eine Weiterentwicklung von pF69 dar. Da es zunächst aufgrund von Klonierungsproblemen nicht gelang, aroB als viertes Gen mit auf das Plasmid pF69 zu integrieren, wurde 90
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Seite 106 und 107: 6.2. Darstellung und Isolierung der
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Seite 130 und 131: 6.6. Entwicklung eines Fed-Batch Fe
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Seite 136 und 137: DHS / BTM [mmol/g] 8 7 6 5 4 3 2 1
Seite 138 und 139: S3P / BTM [mmol/g] 1,4 1,2 1,0 0,8
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Seite 144 und 145: 6.6. Entwicklung eines Fed-Batch Fe
Seite 146 und 147: G6P [mM] PEP [mM] 1,0 0,8 0,6 0,4 0
Seite 148 und 149: 6.7. Glukosepulsexperimente mit L-P
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Seite 158 und 159: G6P/F6P[µM] FBP [µM] DHAP/GAP[µM
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G6P/F6P[µM] FBP [µM] DHAP / GAP [
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[-] 1 PEP + E4P DAHP DHQ DHS SHIK S
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6.8. Analyse des Produktstoffwechse
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7. Zusammenfassung Am Beispiel der
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(10 mM) im Vergleich zum 3-Dehydroq
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8. Ausblick • Basierend auf den g
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A. Fermentationsmedien A.1. Luria-B
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A.5. Hauptkulturmedium Nr. I Bis au
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A.8. Chemikalienverzeichnis Für di
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Literaturverzeichnis [1] Adachi, O.
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Literaturverzeichnis [26] Budzinski
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Literaturverzeichnis [53] Duke, C.C
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