Metabolomanalyse zur Untersuchung der Dynamik im ...

4.5. Aufarbeitung von Metaboliten der Aromatenbiosynthese
und mit 500 mL Wasser gewaschenem DE–52 Anionenaustauscher (Whatman) gefüllt war.
Nach Waschen der Säule mit 400 mL Wasser erfolgte die Elution mit 100 gh −1 eines linearen
Triethylammonium Hydrogencarbonat Gradienten von 100–400 mM (4 L 100 mM + 4 L
400 mM), wobei Fraktionen von 10 mL gesammelt wurden. Die Fraktionskontrolle für DAH
und DAHP erfolgte mit dem Thiobarbiturat–Assay (Kap. 5.3.6), und Phosphat wurde mit
dem Test nach Ames überprüft (Kap. 5.3.7). Die Produkt–Fraktionen (20–58 für DAH)
wurden vereinigt und im Vakuum eingeengt. Der Puffer wurde durch azeotrope Destillation
mit 5 x 100 mL 2–Propanol im Vakuum entfernt.
Der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und über eine Kationenaustauschersäule
mit Dowex 50 X8 (mesh 100–200) in der H + –Form eluiert. Durch Lyophilisation wurde
ein blass–gelber Rückstand von DAH (freie Säure) erhalten, dessen stark hygroskopisches
Verhalten die Handhabung erschwerte. Durch Neutralisation mit 0,25 M LiOH–Lösung und
anschließender Lyophilisation wurde das Lithium Salz als ebenfalls blass–gelber Feststoff
erhalten, der aber weniger hygroskopisch ist. Für DAHP konnten nur sehr geringe Mengen
in den Fraktionen 90–95 mit LC–MS festgestellt werden, die folgende Produktisolierung war
nicht erfolgreich. Fraktionen, die DAHP enthielten, und das DAH wurden bei –80 ◦ C bis zur
Verwendung gelagert.
4.5.2. 3–Dehydroquinat (DHQ)
Die Synthese erfolgte durch Oxidation von Chinasäure mit konzentrierter Salpetersäure [76].
Dazu wurden 20 g Chinasäure in einem 50 mL Kolben mit Doppelmantel in 12 mL Wasser
aufgeschlämmt, über einen Kryostaten auf 0 ◦ C gekühlt und mit einem Magnetrührer
durchmischt. 27 mL 65%ige Salpetersäure wurden hinzugefügt. Zum Starten der Reaktion
wurden der Reaktionslösung weitere 3 mL 65 %ige Salpetersäure zugesetzt und auf 20
◦ C erwärmt. Nach kurzer Zeit war das Anspringen der Reaktion durch die Entwicklung
nitroser Gase und der damit verbundenen gelb–grünen Färbung der Reaktionsmischung zu
beobachten, und die Temperatur wurde daraufhin sofort wieder auf 0 ◦ C herabgesetzt. Der
Reaktionsfortschritt ließ sich über 1 H–NMRund HPLC verfolgen und wurde nach 24 h
durch Ausblasen der nitrosen Gase und Verdünnung der Reaktionslösung mit Wasser auf 4
L gestoppt.
Die saure Produktlösung wurde ionenchromatographisch aufgearbeitet [81]. Dazu wurde
eine Anionenaustauschersäule mit 300 mL Dowex 1 X8 (mesh 100–200) verwendet, die
mit Acetat als Gegenion äquilibriert wurde. Danach wurden 100 mL Produktlösung mit
50 gh −1 auf die Säule aufgetragen und anschließend mit 1 L Wasser (50 gh −1 ) gewaschen.
Die Elution erfolgte mit 75 gh −1 durch einen nicht–linearen Essigsäure–Gradienten von 0,5–
6,0 M (4 L 6 M + 1 L 0,5 M), und Fraktionen von 10 mL wurden gesammelt. Die Fraktionskontrolle
erfolgte mit HPLC (Kap. 5.3.1), die Produkt–Fraktionen wurden vereinigt und
bei 30 ◦ C im Rotationsverdampfer eingeengt. Die Kristallisation des Produkts aus Aceton
gelang nicht, daher wurde das Produkt in Wasser aufgenommen und die Konzentration der
Produktlösung mit 1 H–NMRgemessen. Die so erhaltene standardisierte Lösung wurde bis
zur Verwendung bei –80 ◦ C gelagert.
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