Metabolomanalyse zur Untersuchung der Dynamik im ...

4.3. Aufbau und Durchführung der Fermentationsexperimente im 20 L Bioreaktor
4.1) und einer Rührerdrehzahl von 1000 Umin −1 kalibriert werden. Die Kalibration der
CO2–Abgasanalytik erfolgte mit reinem Stickstoff und einem Kalibriergas mit 10 % CO2
(Linde).
Alle benötigten Dosierstrecken (Ammoniak–, Glukose– und L–Tyrosinzufuhr) wurden an
den Bioreaktor steril angeschlossen. Zu Beginn der Fermentation wurde die Rührerdrehzahl
auf 300 U min −1 eingestellt und die Zuluft auf 1 Lmin −1 reduziert, um ein Ausstrippen von
CO2 und damit ein verzögertes Anwachsen der Biomasse zu vermeiden [31]. Anschließend
erfolgte das Beimpfen mit 0,7 L der Vorkultur über eine Impfstrecke. Die Datenaufnahme
wurde gestartet, und die Batch–Phase der Kultivierung begann. Um den steigenden
Sauerstoffbedarf der wachsenden Bakterienkultur zu decken, wurden schrittweise die
Rührerdrehzahl und die Begasungsrate erhöht, sobald der pO2 auf etwa 30 % gefallen
war. Während des Experimentes wurden in regelmäßigen Zeitabständen von 1 bis 2 h 10
mL Probe entnommen. Gemessen wurden pH–Wert, Glukosekonzentration, OD650 und die
Biotrockenmasse (BTM). Jeweils 2 ml Zellsuspension wurden 10 min bei 13000 g zentrifugiert
(Biofuge pico, Heraeus) und der Überstand für spätere Analytik bei –28 ◦ C eingefroren.
Bei einer OD650 von rund 10–12 wurden 7 mL 0,1 M IPTG–Lösung als Induktor zur
Bakterienkultur zugegeben, um die Expression der Plasmidgene zu starten. Außerdem
wurde die Glukosezufütterung mit einer 500 g L −1 Glukoselösung (Anhang A.7) über
eine gravimetrische Dosierstrecke (IP65/YFC01Z, Sartorius) gestartet, um während der
gesamten Wachstumsphase im Fermentationsmedium eine Glukosekonzentration von 2–5
g L −1 sicherzustellen. Außerdem wurde mit der L–Tyrosinzufuhr (18,75 g L −1 , Anhang A.7)
über eine Dosimat–Dosierstrecke (Dosimat665, Metrohm) begonnen. Bei den Experimenten
mit L–Tyr Limitierung betrug der Anfangswert der Tyrosindosierung 1 mL min −1 und
wurde während der Wachstumsphase schrittweise auf 3 mL min −1 erhöht, insgesamt wurden
149 mL L–Tyr Lösung zudosiert. Danach wurde die Dosierung auf 3 mL h −1 reduziert,
was einen leichten Erhaltungsstoffwechsel, aber kein Wachstum mehr ermöglichte. Bei
den Experimenten mit L–Tyr Überschuss wurde die L–Tyr Dosierung ebenfalls mit 1
mL min −1 gestartet und während der Wachstumsphase schrittweise auf 3 mL min −1 erhöht,
so dass der Kultur bis zur Einleitung der Glukoselimitierungsphase 300 mL L–Tyrosinlösung
zugegeben wurden. Um eine potenzielle Schädigung bzw. Aktivitätseinbußen von AroF wt
durch unphysiologisch hohe L–Tyr Konzentrationen zu vermeiden, wurde die L–Tyr Menge
im Prozess so zugefüttert, dass die Konzentration nie über das Anfangsniveau hinausging.
Nach Erreichen einer OD650 von etwa 50 (entspricht einer BTM von etwa 16–20 g L −1 )
wurde durch das Herabsetzen der Glukosezufuhr auf 50 g h −1 die Limitierungsphase eingeleitet.
Nachdem die gesamte Glukose im Medium verbraucht war, blieb die Kultur für rund
30 min limitiert. Anschließend erfolgte die Auslösung des Glukosepulses und der Start der
schnellen Probenahme, in dessen Verlauf der Stoffwechsel der Zellen durch das Methanol–
Quenching–Verfahren [48] gestoppt wurde (Kapitel 4.3.2).
4.3.2. Glukose Pulssystem und schnelle Probenahmeeinheit
Das Pulssystem besteht aus einem Pulsbehälter für die Aufnahme der Glukosepulslösung
und den zwei Pulsventilen mit dazugehörigen Anstechnadeln, die über Druckleitungen
miteinander verbunden sind (Abb. 4.5). Durch das Öffnen der beiden Pulsventile, die von
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