Metabolomanalyse zur Untersuchung der Dynamik im ...

6.7. Glukosepulsexperimente mit L–Phenylalanin Produktionsstämmen
offenbar durch die Verringerung der maximalen Glukoseaufnahmerate verursacht worden,
deren Ursache in der L–Tyr Limitierung vermutet worden war. Trotz der auch bei E. coli
4pF20 vorliegenden Limitierung durch den AroB Schritt war die Pulsanregung stark genug,
um die dahinter liegenden Metabolitpools von DHQ, DHS, Shikimat und S3P anzuregen.
Die großen Pools von DAHP und DAH zeigten deutlich, dass auch hier AroB sehr
stark limitierend war. Die geringe Auswirkung im DHQ–Pool deutete daraufhin, dass die
Reaktion von DHQ zu DHS sehr schnell verlief und dass AroD daher nicht limitierend
war. Im Gegensatz dazu wies der Verlauf von DHS und Shikimat auf eine langsamere
Reaktion von AroE bzw. AroL hin. Im S3P–Pool war daher eine im Vergleich schwächere
Dynamik zu erkennen, die vermutlich ihre Ursache in der sequentiellen Dämpfung des
Pulssignals durch die limitierenden Schritte von AroB, AroE und AroL hatte. Daraus ergab
sich die Fragestellung, wie sich die Verhältnisse im Aromatenbiosyntheseweg nach einer
Pulsstimulation ändern würden, wenn eines der limitierenden Gene überexprimiert würde.
Im Gegensatz zu aroE und aroL bot aroB dafür ein hervorragendes Ziel, da es das zweite
Gen des Stoffwechselwegs ist und die Wirkung seiner Überexpression in den nachfolgenden
Pools von DHQ, DHS, Shikimat und S3P gut studiert werden könnte.
Die Messungen der Proben mit enzymatischen Methoden und mit der Triple Quadrupol
LC–MS lieferten zwei sowohl qualitativ, als auch quantitativ unterschiedliche Datensätze.
Die enzymatischen Daten zeigten Konzentrationen, die um einen Faktor von 10–15 höher
lagen. Durch Experimente mit Ultrafiltration der Proben konnten die vermeintlich hohen
Konzentrationen als Mess–Artefakte der Probenmatrix identifiziert werden. Daher wurde
für weitere Experimente auf den Einsatz der enzymatischen Messungen verzichtet. Um Probleme
mit Matrixeffekten bei zukünftigen enzymatischen Messungen auszuschließen, sollte
die Standard–Additions–Methode anstatt der sonst üblichen externen Kalibration für die
Quantifizierung von Zellextrakten Anwendung finden.
6.7.3. Glukosepulsexperiment mit E. coli 4pF78
Unter Verwendung der beim Glukosepulsexperiment mit E. coli 4pF20 erfolgreich eingesetzten
Fermentations– und Pulstrategie wurde analog ein Glukosepulsexperiment mit E. coli
4pF78 durchgeführt. Zusätzlich zu aroF fbr und pheA fbr enthält das Plasmid pF78 das Gen
der 3–Dehydroquinat Synthase aroB, um den limitierenden Charakter dieses enzymatischen
Schritts in der Aromatenbiosynthese aufzuheben. Als Folge davon sollte die Bildung von
DAHP und DAH vermieden worden sein und das Glukosepulssignal in den darauf folgenden
Metabolitpools im Vergleich zu E. coli 4pF20 verstärkt worden sein. Der Fermentationsverlauf
ist in Abb. 6.51 zu sehen. Ebenso wie beim Experiment mit E. coli 4pF20 wurde die
L–Tyr Dosierung so gewählt, dass im gesamten Fermentationsverlauf immer in Gegenwart
eines L–Tyr Überschusses gearbeitet wurde. Nach Erreichen einer OD650 = 50 wurde die
Glukosedosierung für die Limitierung reduziert. Aufgrund technischer Schwierigkeiten mit
der schnellen Probenahme konnte die vorgesehene Dauer der Limitierung von 20 min nicht
eingehalten werden, und das Glukosepulsexperiment konnte erst nach 45 min initiiert werden.
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