Metabolomanalyse zur Untersuchung der Dynamik im ...

5. Analytische Methoden
Tabelle 5.8.: Methodenparameter der HPLC für die HPLC–MS Kopplung
Säule 2 x Nucleodex beta–OH 250 x 4.6 mm, 5 µm , Macherey–Nagel)
Temperatur 25 ◦ C
Flussrate 0,5 mL min −1
Injektionsvolumen 20 µL
Detektion MS
Eluent A 12 mM NH4Ac
Eluent B 20 % Eluent A;
80 % Methanol (LC-MS Qualität CHROMASOLV, Riedel-de-Haen)
Gradient 0 min 2 % B, 15 min 2 % B, 30 min 100 % B, 45 min 100 % B
47 min 2 % B, 60 min 2 % B
zwei Säulen (Nucleodex beta–OH, Macherey–Nagel) mit einer Länge von 250 mm und einem
Innendurchmesser von 4.6 mm und einer Teilchengröße von 5 µm in Serie geschaltet (Tab.
5.8).
5.4.4. Ionenfallen LC–MS
Das System besteht aus einer HPLC Anlage (Gynkotek/Dionex), die an ein LCQ Massenspektrometer
(ThermoFinnigan) mit Ionenfallen–Massenfilter (Kap. 3.3.3) und ESI–Quelle
(Kap. 3.3.2) gekoppelt ist (Abb. 5.3). Die verwendete Chromatographie–Methode ist in Kap.
5.4.3 beschrieben. Die Injektion des Probevolumens erfolgte durch einen programmierbaren
Autosampler (ASI100–T, Dionex) und die Gradienten–Elution (Pumpe M480, Gynkotek)
bei 25 ◦ C (Säulenofen, Gynkotek). Vor dem Massendetektor ist ein Dioden–Array–Detektor
(UVD, Dionex) zur UV–Messung im Wellenlängenbereich von 200–595 nm geschaltet. Die
Datenaufnahme, die HPLC Steuerung und die Auswertung der UV–Daten erfolgte mit der
Chromeleon 6.4 Chromatographie Software (Dionex). Die Datenaufnahme, Steuerung und
Auswertung des MS Systems erfolgte mit der Software Xcalibur 1.0 (ThermoFinnigan).
Die Verbindung zum LCQ Massendetektor erfolgte über ein T–Stück, das als Flussteiler
fungierte und 40 µLmin −1 des Elutionsvolumens zum Massendetektor leitete, die anderen
460 µLmin −1 wurden verworfen. Über eine externe HPLC–Pumpe (PU1585, JASCO) wurde
Methanol mit einem Fluss von 25 µLmin −1 über den ”sheath liquid” Anschluss direkt in
den Kopf der ESI–Quelle dosiert. Nach Buchholz [25] diente das der Unterstützung der
Ionisation. Als ”sheath gas” und ”auxiliary gas” wurde Stickstoff verwendet, der durch einen
ölfreien Luft–Kompressor (2000–40, Jun–Air) mit nachgeschalteter Membranfilteranlage
(ECO–Inert ESP2, DWT) bereitgestellt wurde.
Die Parameter für die ESI–Quelle wurden durch manuelle Injektionen aus einer
10 µL Probenschleife in den gesplitteten HPLC–Eluenten ermittelt. Die optimalen Kollisionsenergien
wurden mit einer Standard–Lösung (Eluent A 98 %, Eluent B 2 %) und die
Werte für die Tune–Parameter (tube lens offset, first + second octapole offset, interoctapole
lens offset) wurden mit einer 500 µM G6P Standard–Lösung (Eluent A 98 %, Eluent B 2
%) bestimmt. Dazu wurde die Spritzenpumpe mit einem Fluss von 40 µLmin −1 eingestellt
und die semi–automatische Software–Routine benutzt. In beiden Fällen wurde der ”sheath li-
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