Metabolomanalyse zur Untersuchung der Dynamik im ...

6. Ergebnisse und Diskussion
6.1. Entwicklung und Etablierung der analytischen Techniken
6.1.1. Quantitative 1 H–NMR für die Fermentationsanalytik
Für die Chemie stellt die Kernresonanz–Spektroskopie (NMR) ein wichtiges, wenn nicht
das wichtigste Verfahren zur Identifizierung und Charakterisierung von Syntheseprodukten,
Naturstoffisolaten und anderen strukturchemischen Fragestellungen dar [21]. Sie kann jedoch
auch für die Untersuchung biologischer und biotechnologischer Fragestellungen eingesetzt
werden [43, 49, 93, 147, 161]. Die chemische Verschiebung der Signale und die Signal–
Multiplizität enthalten Informationen über die Struktur der gemessenen Verbindung. Durch
den Bezug auf das Signal einer Referenzsubstanz (interner Standard), wie z.B. Tetramethylsilan,
stellt die chemische Verschiebung eine von der Messfrequenz bzw. Magnetfeldstärke
unabhängige Größe dar, die für den betrachteten Kern in seiner chemischen Umgebung
charakteristisch ist [83]. Neben dieser qualitativen bietet die 1 H–NMRauch eine quantitative
Information. Die Fläche unter der Absorptionskurve eines Protonensignals ist ein Maß für
die Intensität des Übergangs und wird zur Bestimmung der dem Signal zugrunde liegenden
Protonenzahl herangezogen. Bei bekannter Konzentration und Protonenzahl eines internen
Standards kann nun auch die Konzentration der in der Probe enthaltenen Substanzen
einfach berechnet werden.
Umgekehrt betrachtet, erlaubt die 1 H–NMRTechnik die qualitative und quantitative Behandlung
von Fragestellungen, bei denen die zu untersuchenden Verbindungen nicht als Standard
verfügbar sind und daher nicht zur Kalibration herangezogen werden können. Die substanzspezifischen
Daten der 1 H–NMRSpektren für die Qualifizierung können der Literatur
entnommen werden, und die Quantifizierung erfolgt über die Konzentration des internen
Standards. Mit diesem Ansatz wurde von Zaja [191] eine quantitative Fermentationsanalytik
für die Bestimmung von Metaboliten der Aromatenbiosynthese im Fermentationsüberstand
von E. coli etabliert [49, 51]. Mit Ausnahme von Shikimat ist kein Metabolit des
Shikimat–Weges kommerziell erhältlich, und ihre Darstellung ist aufgrund der hohen chemischen
Funktionalisierung aufwendig und zeitintensiv. Dennoch war ein rascher analytischer
Zugang notwendig, um der Stammentwicklung für die L–Phe Prozessentwicklung neue Impulse
zu geben.
6.1.1.1. Probenvorbereitung
Um das unerwünschte H2O Signal bei der NMR-Messung der wässrigen Proben zu unterdrücken,
wird bei der Probenvorbereitung das H2O aus der Probe gegen Deuteriumoxid
(D2O) ausgetauscht [176]. Das D2O enthält eine Konzentration von 4 mM TSP (3–Trimethylsilyl–2,2,3,3–d–propionsäure)
als internen Standard [51]. Für die Entfernung von H2O aus
den Proben wurden Versuche mit Gefriertrocknung und Vakuumzentrifugation durchgeführt.
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