Metabolomanalyse zur Untersuchung der Dynamik im ...

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6.7. Glukosepulsexperimente mit L–Phenylalanin Produktionsstämmen nicht nur im Zentralstoffwechsel, sondern auch im DAHP Pool, dem ersten Metabolit der Aromatenbiosynthese deutlich nachgewiesen werden (Abb. 6.43). Mit Ausnahme von AMP liegen die mit der Triple Quadrupol LC–MS bestimmten intrazellulären Konzentrationen im Bereich ≤ 200 µM , für DHQ und FBP konnten sogar noch Konzentrationen im Bereich von 5 µM detektiert werden. Diese geringen intrazellular gemessenen Konzentrationen unterstreichen die Leistungsfähigkeit der entwickelten Triple Quadrupol LC–MS Methode im Vergleich zur Ionenfallen MS und den enzymatischen Nachweismethoden. Im Vergleich zu intrazellulären Literatur-Daten von Metaboliten des Zentralstoffwechsels von E. coli Wildtyp [25, 33] wurden für die in dieser Arbeit untersuchten rekombinanten E. coli L-Phe Produktionsstämme geringere Konzentrationen (bis zu Faktor 10-100) dieser Metabolite gemessen. Lediglich für AMP wurden nach dem Glukosepuls vergleichbare Konzentrationen bestimmt. In der Zeit vor dem Puls, d.h. dem quasi steady–state, wurde für die meisten Metaboliten eine akzeptable Fließgleichgewichtseinstellung erreicht, obwohl z.B. für G6P oder ATP ein leicht fallender Trend bis zum Puls beobachtet wurde. Nach dem Puls konnte für die meisten Metaboliten eine deutliche Veränderung der Konzentration gemessen werden, außer für DHAP/GAP, die durch den Puls wenig beeinflusst erschienen. Der G6P/F6P–Pool stieg nach dem Puls an, jedoch konnte für PEP kein direkter Abfall aufgrund der höheren Glukoseaufnahme über das PTS beobachtet werden, vielmehr stieg der PEP–Pool kurzfristig auf das 3– bis 4–fache an. Vielleicht war der erwartete PEP Abfall aufgrund der höheren Glukoseaufnahme über das PTS zeitlich nur sehr begrenzt, und die erste gemessene Probe nach dem Puls stellte bereits wieder die Erholung des PEP–Pools dar. Auf der anderen Seite könnte die Zelle über die PEP–Synthase (Pps) das gebildete Pyruvat direkt wieder in PEP rezyklieren, wodurch der Anstieg des PEP Pools verursacht worden sein könnte. Im weiteren Verlauf der Glykolyse wurde ein deutliches Pulssignal für FBP und 2PG/3PG beobachtet, jedoch nicht für DHAP/GAP, die in der Glykolyse dazwischen positioniert sind. Im Pentose–Phosphat–Weg zeigten 6PG und P5P einen Anstieg nach dem Puls, der P5P Pool stieg dabei um den Faktor 6-10. Bei den Nukleotiden zeigte AMP die mit Abstand deutlichste Reaktion auf den Puls, hier wurden kurzfristig 3–4 mM erreicht. Diese hohe AMP–Konzentration nach dem Puls erklärt, warum es bei der Ionenfallen LC–MS als einzige Substanz detektiert werden konnte und der Vergleich der beiden AMP–Verläufe zeigte eine hohe qualitative Übereinstimmung. Jedoch konnten mit der sensitiveren Triple Quadrupol MS nun auch die niedrigen AMP Konzentrationen vor dem Puls gemessen werden. Die NADP Konzentration stieg nach dem Puls leicht an, NADP und NAD erschienen aber im Verlauf kaum verändert. Der ATP Pool stieg nach dem Puls um einen Faktor 2 an. Mit Bezug auf den PEP Anstieg nach dem Puls und einer möglichen Beteiligung der Pps–Reaktion konnte hieraus abgeleitet werden, dass für die Rezyklierung von PEP aus Pyruvat zumindest ein ausreichender ATP Pool bereitgestanden hatte. Das bemerkenswerteste Ergebnis der Messungen war die Detektion von DAHP, dem ersten Metabolit des Aromatenbiosynthesewegs. Die DAHP–Peakfläche stieg unmittelbar nach dem Puls um einen Faktor 5 an. Der DAHP–Verlauf hat eine hohe Ähnlichkeit mit dem von PEP, einem der beiden Vorläufermetaboliten von DAHP. Das lässt den Schluss zu, dass die Erhöhung des PEP–Pools nach dem Puls zu einer Erhöhung des Flusses in den Aromatenbiosyntheseweg führte. Der andere Vorläufermetabolit E4P konnte in den Proben 123
6. Ergebnisse und Diskussion G6P/F6P[�M] 6PG [µM] DHAP/GAP[�M] 80 70 60 50 40 30 20 10 0 -5 0 5 10 15 20 25 30 15 10 5 Zeit [s] G6P / F6P 0 -5 0 5 10 15 20 25 30 80 60 40 20 Zeit [s] 0 -5 0 5 10 15 20 25 30 Zeit [s] 6PG DHAP / GAP PEP [µM] P5P [�M] FBP [µM] 80 70 60 50 40 30 20 10 100 120 100 0 -5 0 5 10 15 20 25 30 80 60 40 20 80 60 40 20 Zeit [s] FBP 0 -5 0 5 10 15 20 25 30 Zeit [s] PEP 120 P5P 0 -5 0 5 10 15 20 25 30 Zeit [s] Abbildung 6.42.: Pulsexperiment E. coli 4pF49: Triple Quadrupol LC–MS Messung intrazellulärer Metaboliten Teil I; Linien stellen die mit dem FFT-Filter geglätteten Daten dar 124
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4. Material und Methoden 4.1. Biolo
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5. Analytische Methoden 5.1. Biomas
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5.3. Extrazelluläre Analytik Tabel
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Glukose [g/L] Tabelle 5.4.: Enzymat
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5.4. Intrazelluläre Analytik Tabel
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Abbildung 5.3.: Foto der Ionenfalle
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Tabelle 5.10.: Methodenparameter de
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5.4.6. Durchführung der Standard-A
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6. Ergebnisse und Diskussion 6.1. E
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Nachweisgrenze [mM] 16 12 8 4 6.1.
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L-Phe [mM] Acetat [mM] Shikimat [mM
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6.1. Entwicklung und Etablierung de
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MS Peakfläche [-] MS Peakfläche [
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H HO H H CHO OH H OH OH CH 2 O P Gl
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Seite 158 und 159: G6P/F6P[µM] FBP [µM] DHAP/GAP[µM
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