Metabolomanalyse zur Untersuchung der Dynamik im ...

5.4. Intrazelluläre Analytik
Tabelle 5.7.: Enzymatischer Assay zur Bestimmung von 6–Phosphoglukonat
Komponente Reagenzien Volumen
[µL]
Probe 125
Glycylglycin–MgCl2–Puffer Glycylglycin 14,8 g L −1 155
MgCl2 · 6H2O 1,574 g L −1
pH–Wert mit KOH auf 8,0
NADP NADP 19,3 mg mL −1 10
6PG–DH 19 mg mL −1 (41 U/mg) 10
1:125 in Glycylglycin–MgCl2–Puffer
angezeigt. Als erstes werden die Puffer–Lösungen, eventuell zusätzliche Salze und Kofaktoren
in die Kavitäten der Mikrotiterplatte pipettiert. Danach werden die Standardlösungen
und Proben pipettiert und die Mikrotiterplatte homogenisiert (Titrimax, Heidolph). Vor der
Zugabe der Enzyme wird der Nullwert im Mikrotiterplattenphotometer (Thermomax, Molecular
Devices) bei einer Wellenlänge von λ = 340 nm gemessen. Nach der Zugabe der Enzyme
wird die Platte wiederum homogenisiert und für 2 h bei 25 ◦ C inkubiert.
Nach der Inkubation wird die Platte erneut bei 340 nm gemessen und die Absorptionsänderung
zur Berechnung der Konzentration in den Proben verwendet. Auf jeder Platte werden
Standardlösungen im Bereich von 5–150 µM pipettiert, die zur Aufstellung der Kalibriergeraden
verwendet werden. Die Testbedingungen und die experimentelle Durchführung der
Enzymtests für die Metaboliten Glukose–6–phosphat (G6P), Fruktose–6–phosphat (F6P),
Fruktose–1,6–bisphosphat (FBP), Dihydroxyacetonphosphat (DHAP), Glyceraldehyd–3–
phosphat (GAP), Phosphoenolpyruvat (PEP) und Pyruvat (Pyr) sind den Arbeiten von
Buchholz [24] und Kunze [100] zu entnehmen.
5.4.2. Enzymatische Bestimmung von 6–Phosphoglukonat (6PG)
Bei diesem Test wird 6PG durch das Enzym 6–Phosphoglukonat Dehydrogenase (6PG–DH)
zu 3–Keto–6–phosphoglukonat umgesetzt (Gleichung 5.5). Dabei wird NADP zu NADPH
reduziert, dessen Bildung aufgrund der UV–Aktivität bei λ =340 nm verfolgt werden kann.
Die gebildete NADPH Menge ist dabei proportional zur 6PG–Konzentration. Die Messung
wurde in Mikrotiterplatten mit 96 Kavitäten (Beckman Instruments) als Dreifachbestimmung
durchgeführt. Zu 155 µL Glycylglycin/MgCl2 Pufferlösung wurden 10 µL NADP–
Lösung, 125 µL Probe und 10 µL der verdünnten 6PG–DH Lösung pipettiert (Tab. 5.7). Nach
2 h Inkubationszeit bei 30 ◦ C wurde die Absorption im Mikrotiterplattenphotometer (Thermomax,
Molecular Devices) gemessen.
6–Phosphoglukonat + NADP +
5.4.3. HPLC–Methode für die MS–Kopplung
6PG−DH
−−−−−−→ 3–Keto–6–phosphoglukonat + NADPH + H +
(5.5)
Für die Chromatographie vor der massenspektrometrischen Detektion wurde weitgehend auf
das von Buchholz [23] verwendete System zurückgegriffen. Für die Chromatographie wurden
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