Metabolomanalyse zur Untersuchung der Dynamik im ...

6. Ergebnisse und Diskussion
6.1.2. HPLC–MS (Triple Quadrupol) für die intrazelluläre Analytik
Die Einsatzmöglichkeiten eines HPLC–MS Systems für die intrazelluläre Analytik von
Metaboliten aus dem Zentralstoffwechsel sind bereits mit einem Ionenfallen MS–System
untersucht worden [23]. Wie bereits in Kap. 3.3.3 dargestellt, kann mit der Ionenfallentechnik
im Vergleich zu MS–Geräten mit Triple Quadrupol Technik nur eine geringere
Empfindlichkeit erzielt werden, und daher zeigen sie Nachteile im Bereich der Quantifizierung.
Besonders gravierend wirken sich diese Aspekte im Bereich kleiner Metaboliten
(< 400 g mol −1 ) aus. Gerade für die Metabolitanalytik ist das jedoch ein problematischer
Aspekt, da viele Metaboliten des Zentralstoffwechsels (Glykolyse, Pentose–Phosphat–Weg)
und auch von anabolen Biosynthesewegen (z.B. Aromatenbiosynthese) eine Molmasse im
Bereich von < 400 g mol −1 haben.
In ersten Untersuchungen mit der Ionenfallen LC–MS wurde deutlich, dass das MS System
voraussichtlich keine ausreichende Empfindlichkeit besitzen würde, um die Metaboliten der
Aromatenbiosynthese auf intrazellulärem Niveau erfassen zu können. Mit der Triple Quadrupol
MS Technik (Kap. 3.3.4) können die höchsten Empfindlichkeiten erreicht werden, daher
wurde die neue Analytik mit diesem System aufgebaut. Auf der Seite der HPLC wurde auf
die von Buchholz et al. [23] etablierte Methode zurückgegriffen (Kap. 5.4.3), da die Metaboliten
der L–Phe Biosynthese unter diesen Bedingungen vergleichbare Retentionszeiten wie
die bereits in der Methode etablierten Metaboliten des Zentralstoffwechsels zeigten. Auf der
Seite der MS wurden zunächst die Parameter der ESI–Quelle an die Bedingungen der HPLC
adaptiert. Anschließend wurden die substanzspezifischen MS/MS Parameter der Metaboliten
des Zentralstoffwechsels für das Triple Quadrupol MS etabliert und im zweiten Schritt durch
die Parameter der Metaboliten der L–Phe Biosynthese erweitert.
6.1.2.1. Optimierung der ESI Parameter
Die Optimierung der Parameter der ESI ist von großer Bedeutung für die Empfindlichkeit,
Reproduzierbarkeit und Quantifizierbarkeit der Messungen. Die Ionenbildung im
Elektrospray sollte sehr gleichmäßig erfolgen (= stabiles Spray) und dabei eine möglichst
hohe Ionisierungseffizienz aufweisen. Als wichtige Einfluss–Parameter für die Ionisierung
an dem verwendeten Triple Quadrupol MS sind zu nennen: Volumenfluss von der HPLC,
Stickstoff–Ströme des ´sheath´–(Mantel) und ´auxiliary´–Gases für die Vernebelung,
die Spannung an der ´tube lens´ und die Spannung bzw. Temperatur an der Kapillare.
Die beiden letzten Parameter kontrollieren maßgeblich die Überschuss–Ladung auf
den gebildeten Tropfen bzw. den Temperatur bedingten Energieeintrag bei der Ionenbildung.
Außer der ´tube lens´ Spannung handelte es sich um klassische ESI–Quellen Parameter,
die weitgehend unabhängig vom m/z Verhältnis der Analyt–Ionen waren. Die ´tube lens´
Spannung hatte sowohl die Aufgabe, verbliebene Ionencluster durch Stöße mit Gasmolekülen
zu zerschlagen, als auch ein Maximum aller bis dahin bereits gebildeten Ionen in Richtung
auf die Quadrupole zu transmittieren. Die optimalen Transmissionseigenschaften dieser
elektromagnetischen Linse waren aber vom m/z Verhältnis der Ionen abhängig. Es genügte
hierbei jedoch die Kalibrierung für ein m/z, aus der dann der optimale Wert für den
vollständigen m/z Bereich von der Software abgeleitet werden konnte. Die Eigenschaft
der Entclusterung stellt in erster Näherung eine Energiezufuhr dar, weshalb zwischen der
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