Metabolomanalyse zur Untersuchung der Dynamik im ...

3. Theoretische Grundlagen
3.2.4. Zulaufverfahren mit wachstumsentkoppelter Produktionsphase
Die in diesem Verfahren eingesetzten Produktionsstämme sind aufgrund einer gentechnischen
Veränderung auxotroph für einen bestimmten Nährstoff, z.B. eine Aminosäure. Nur wenn
dieser Nährstoff im Prozess zugefüttert wird, können die Zellen wachsen. Dieser Nährstoff
kann entweder vollständig im Fermentationsmedium vorgelegt oder im Verlauf der Fermentation
zudosiert werden, um die Bildung der Biomasse zu ermöglichen. Ein ungehindertes
Wachstum der Biomasse und eine damit verbundene zu große Biomassekonzentration kann
zu verfahrenstechnischen Problemen in Bezug auf die Nährstoffversorgung und vor allem
den unzureichenden Sauerstoffeintrag in den Bioreaktor führen. Daher wird das Wachstum
im Fermentationsverlauf über die Zugabe des Nährstoffes kontrolliert, der die Auxotrophie
komplementiert. Sobald er nicht mehr zur Verfügung steht, endet die Wachstumsphase der
Biomasse. Da sie aber immer noch ein hohes biosynthetisches Potenzial bereitstellt, wird
das gewünschte Produkt in dieser Phase immer noch gebildet, ohne noch Substrat für das
Wachstum der Biomasse aufwenden zu müssen. Diese Phase wird als wachstumsentkoppelte
Produktionsphase verstanden. Dieses Entkopplungsprinzip von Zellwachstum und Produktbildung
ist auch Grundlage für die Prozessentwicklung eines E. coli basierten L–Phe
Produktionsprozesses gewesen [70].
3.3. Analytische Grundlagen
3.3.1. LC–MS Kopplung
Im Vergleich zur Gaschromatographie–Massenspektrometrie Kopplung (GC–MS) hat sich
die Verbindung zwischen der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC, kurz LC)
und der MS bei weitem nicht so schnell in der Analytik etabliert. Der Grund liegt im
drastischen Unterschied der physikalischen Umgebungen, in denen die jeweiligen Verfahren
arbeiten, d.h. in der Schwierigkeit, die Analyt–Moleküle aus einer Lösung bei Normaldruck
ins Hochvakuum des MS als gasförmige Ionen zu transferieren [95, 164]. Die Problematik
dieser Situation wurde treffend mit der ungleichen Liebe zwischen einem Fisch (LC)
und einem Vogel (MS) charakterisiert [5]. Mit der Entwicklung von Atmosphärendruck–
Ionisations–Verfahren (API) kann die MS heute als leistungsfähiger Detektor für die LC
eingesetzt werden. Im Vergleich zu anderen klassischen LC–Detektoren, wie UV, RI oder
elektrochemischen Detektoren eröffnen die MS–Detektoren eine weitere Dimension der
Trennung, nämlich nach dem Verhältnis von Masse zu Ladung (m/z) 3 . Der MS–Detektor ist
in der Lage, Substanzen mit gleicher oder überlappender Retentionszeit zu unterscheiden,
sofern sie nicht isobar sind, d.h. die gleiche Masse besitzen.
Die enormen Vorteile der MS–Detektion sind jedoch auch mit Nachteilen gekoppelt. Auf
der Seite der LC ist man auf die Verwendung MS–kompatibler flüchtiger Puffersubstanzen
wie Ammoniumacetat, Ammoniumformiat oder Essigsäure und kompatiblem Lösungsmittel
wie Methanol, Acetonitril oder 2–Propanol angewiesen. Das bedeutet also den Ausschluss
von phosphathaltigen Puffern und Ionenpaar–Reagenzien. Dadurch verringern sich die
chromatographischen Freiheitsgrade für die LC Trennung, was jedoch in der Regel durch
den Einsatz des MS–Detektors mehr als kompensiert wird. Die LC hat daher nicht mehr
3 Im Sprachgebrauch der Massenspektrometrie wird der Begriff der ”Masse” in der Regel synonym mit dem
Verhältnis aus Masse zu Ladung m/z verwendet [150].
22