Metabolomanalyse zur Untersuchung der Dynamik im ...

4. Material und Methoden
4.5.3. 3–Dehydroshikimat (DHS)
4.5.3.1. Extraktion mit Ethylacetat
Die Fermentationslösung aus dem Bioreaktor wurde zunächst für 20 min bei 15 900 g zur
Separation der Zellen zentrifugiert (Avanti J-20XP, Beckman Instruments). Die nun zellfreie
Produktlösung wurde mit 6 N HCl auf pH = 2,5 angesäuert. Die kontinuierliche Extraktion
wurde mit einem 1 L Perforator für leichte Extraktionsphasen unter Einsatz von 500 mL Produktlösung
und ca. 700 mL Ethylacetat sowohl mit als auch ohne vorhergehende Ultrafiltration
(Ausschlussgrenze 10 kDa ) durchgeführt. Wegen mangelnder Phasentrennung mussten
beide Versuche bereits nach einer Laufzeit von rund 30 min abgebrochen werden. Stattdessen
wurden 500 mL der angesäuerten Produktlösung mehrmals mit Ethylacetat extrahiert, die
organische Phase über MgSO4 getrocknet und die vereinigten organischen Phasen im Rotationsverdampfer
auf ein Volumen von etwa 100 mL reduziert. Nach 1 Woche bei 5 ◦ Cwar
ein Teil des Produkts in der Lösung kristallisiert. Zur Reduzierung des Lösungsmittelanteils
wurde das blass–beige farbige Produkt fünf Tage lang im Vakuum getrocknet und bis zur
Verwendung bei –80 ◦ C gelagert.
4.5.3.2. Ionenchromatographie
Die zellfreie Fermentationslösung wurde ionenchromatographisch aufgearbeitet [81]. Dazu
wurde eine Anionenaustauschersäule mit 300 mL Dowex 1 X8 (mesh 100–200) verwendet,
die mit Acetat als Gegenion äquilibriert wurde. Danach wurden 100 mL Produktlösung mit 50
gh −1 auf die Säule aufgetragen und anschließend mit 1 L Wasser (50 gh −1 ) gewaschen. Die
Elution erfolgte mit 75 gh −1 durch einen nicht linearen Essigsäure–Gradienten von 0,5–6,0 M
(4 L 6 M + 1 L 0,5 M) und Fraktionen von 10 mL wurden gesammelt. Die Fraktionskontrolle
erfolgte mit HPLC (Kap. 5.3.1), die Produkt–Fraktionen 195–220 wurden vereinigt, bei 30
◦ C im Rotationsverdampfer eingeengt und im Vakuum für 5 Tage lang getrocknet. Es wurde
ein blass–beige farbiges, teils kristallines Produkt erhalten, das bis zur Verwendung bei –80
◦ C gelagert wurde.
4.5.4. Shikimat–3–phosphat (S3P)
Die Fermentationslösung aus dem Bioreaktor wurde zunächst für 20 min bei 15 900 g
zur Separation der Zellen zentrifugiert (Avanti J-20XP, Beckman Instruments) und mit
Ionenchromatographie aufgereinigt [37, 49]. Der zellfreie Fermentationsüberstand (1400
mL) passierte zunächst eine Kationenaustauschersäule, die mit 700 mL Dowex 50 X8
(mesh 100–200) in der H + –Form gefüllt war, mit einem Fluss von 100 gh −1 bei 4 ◦ C.
Nach dem Waschen der Säule mit 500 mL Wasser wurde das vereinigte Eluat mit 2 M
LiOH–Lösung auf pH = 8 titriert und das Wasser im Vakuum entfernt. Zu diesem Feststoff
wurde 1 L Methanol zugesetzt und eine Stunde bei 4 ◦ C kräftig gerührt. Nach Filtration
des weißlich–gelben Rückstands, der nach Analyse nahezu kein Produkt enthält, wurde das
Lösungsmittel im Vakuum entfernt.
Der produkthaltige Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und mit Wasser verdünnt,
bis die Leitfähigkeit < 1,5 mS betrug. Der pH–Wert wurde mit 5 M Ammoniak–Lösung auf
pH = 8,5 eingestellt. Die Lösung wurde bei 4 ◦ C mit 100 gh −1 auf eine Säule aufgebracht,
die mit 700 mL präzyklisiertem und mit Ammoniumhydrogencarbonat äquilibriertem DE–52
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