Metabolomanalyse zur Untersuchung der Dynamik im ...

6. Ergebnisse und Diskussion
nach dem Puls einen Anstieg der Konzentration.
Im Bereich des Aromatenbiosynthesewegs sind sehr deutliche Unterschiede zu E. coli
4pF20 zu erkennen, die eindeutig mit der Überexpression von aroB korrelieren. Als Folge
der Überexpression ist die Geschwindigkeit der Umsetzung von DAHP zu DHQ offenbar
so stark beschleunigt worden, dass kein DAHP–Pool mehr nachweisbar war. Das hatte zur
Folge, dass die bisher nicht limitierende Reaktion der 3–Dehydroquinat Dehydratase (AroD)
von DHQ zu DHS limitierend wird, was an dem deutlichen Anstieg des DHQ–Pools von
etwa 500 auf 2500 µM nach dem Puls zu erkennen ist. Der bereits als limitierend eingestufte
Charakter der Reaktion von DHS zu Shikimat wurde dadurch weiter verstärkt, was an dem
enormen Anstieg des DHS–Pools von etwa 500 auf 5000 µM beobachtet werden konnte.
Im Vergleich zu 4pF20 sind die hier beobachteten Poolgrößen für DHQ und DHS um
einen Faktor 10–200 größer, und auch die dynamische Änderung der Poolgrößen war mit
einem Faktor 10 deutlich größer als bei E. coli 4pF20. Bei Shikimat und S3P war diese
große, sehr stark ausgeprägte Dynamik nicht mehr erkennbar. Vielmehr konnte hier sogar
ein leicht fallender Trend nachgewiesen werden, allerdings sind beide Pools im Vergleich
zu E. coli 4pF20 deutlich erhöht. Durch die 30–fache Erhöhung der Shikimatkonzentration
könnte eine Aktivierung der Feedback–Inhibierung der Shikimat Dehydrogenase (AroE)
durch Shikimat verbunden gewesen sein [49]. Die durch die Inhibierung reduzierte Aktivität
von AroE führte offenbar zu einer Dämpfung des Pulssignals, weswegen bei Shikimat und
S3P die starke Dynamik aus den DHQ und DHS Pools nicht mehr zu erkennen war. Die
weiterführende Auswertung und Interpretation der gemessenen Dynamik in den Metaboliten
der Aromatenbiosynthese wurde mit statistischen Analysemethoden durchgeführt und ist in
Kapitel 6.8 dargestellt.
6.7.3.2. Zusammenfassung der Ergebnisse mit E. coli 4pF78
Die Messung der Proben aus dem Experiment mit E. coli 4pF78 erfolgte ausschließlich
mit der Triple Quadrupol LC–MS. Die veränderte Fermentations– und Pulsstrategie konnte
auf E. coli 4pF78 angewendet werden. Nach der Pulsstimulation der Glukose limitierten,
jedoch nicht L–Tyr limitierten Kultur konnte das Pulssignal im Zentralstoffwechsel und in
der Aromatenbiosynthese detektiert werden. Durch die Überexpression von aroB konnte kein
DAHP–Pool mehr nachgewiesen werden, und das Signal in den folgenden Metabolitpools von
DHQ und DHS wurde deutlich verstärkt. Der damit verbundene höhere Shikimat–Pool aktivierte
offenbar die Feedback–Inhibierung der Shikimat Dehydrogenase (AroE) und dämpfte
das Pulssignal so stark, dass es den Shikimat– und S3P–Pool nicht mehr erreichen konnte.
Im Vergleich zu den beiden Experimenten mit E. coli 4pF49 und E. coli 4pF20 wurde
für PEP kein Anstieg mehr nach dem Puls beobachtet, vielmehr fiel PEP nach dem Puls
auf ein Drittel der Vorpulskonzentration, was auf einen erhöhten PEP–Verbrauch durch die
Aromatenbiosynthese hindeuten könnte.
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