Arrestin hetero/oge Expression/l Mutagenese und biophy,sikalische Untersuchungen

ERGEBNISSE
(Ergebnisse sind nicht gezeigt). In Abb. 3.17. sind die gerermgten und konzentrierten
p44-Proteine im SDS Gel dargestellt. In Spur 3 ist Strep'I'agll-p-l-l aus Klon 70.8, in Spur 4
6His-p44 aus Klon 75.8 und in Spur 5 6His-Xa-p44 aus Klon 71.13 aufgetragen. Im Vergleich
mit Arrestin aus dem Rinderauge (Abb. 3.17. Spur 6) ist der GroBenunterschied von -4 kDa
gut zu erkennen, die p44-Derivate haben aile in etwa die gleiche GroBe. Die in den Spuren 3
und 4 aufgetragenen Mengen entsprechen 1116 (3 JlI aus 50 JlI) der isolierten Proteinmenge.
Es lassen sich maximal 1110 der Arrestinausbeute gewinnen (-3,5 Jlg Protein aus etwa I g
Zellen).
Der fehlende C-Terminus scheint entscheidenden EinfluB auf die Li.islichkeit des Proteins zu
haben. Nach dem Hefe-Zellaufschluf mit Puffer 10/400 liegt der pH-Wert der Uberstande bei
etwa pH = 5,5. Die im ZellaufschluBpuffer enthaltene Puffersubstanz von 10 mM HEPES war
nicht ausreichend urn den pH Wert zu stabilisieren. Die Moglichkeit besteht, daB der
auftretende "pH-Shift" beim ZellaufschluB zur Prazipitation von p44 ftlhrt (D. Eidhoff, pers.
Mitteilung). Dies bedeutet, daB im Gegensatz zum Arrestin, das p44 sehr stark pHempfindlich
ist. Es wurde daher ein Zellpellet des Klons 70.8 (StrepTagII-p44) in
Phosphatpuffer (200 mM K3P04, pH 8,0) aufgeschlossen und anschlieBend entsprechend
Kapitel 2.9, Tab. 2.6. das Protein gereinigt. Die Ausbeute an StrepTagII-p44 ist nun
vergleichbar mit der Arrestin-Strep'I'agll Praparation. In Abb. 3.17. in den Spuren 7 und 9 ist
die Pelletfraktion, in den Spuren 8 und 10 das p44-Konzentrat dargestellt. In der
Westernblotanalyse ist nur ein geringer Teil von p44 im Pellet (Abb.3.17. Spur 9). Das
Konzentrat enthalt kein sehr sauberes Protein, aber die gute Loslichkeit und Isolierbarkeit des
exprimierten StrepTagII-p44 ist erwiesen. Entsprechende Resultate ergeben sich auch fur das
6His-p44 aus dem Klon 75.8.
Durch Optimierung von ZellaufschluB und Reinigung ist es moglich p44 aus S. cerevisiae in
ausreichenden Mengen fiir die Kristallisation zu gewinnen.
3.5. Zentrifugations-Bindungs-Assays zurn
Funktionalitat von in S. cerevisiae
Arrestinen
Nachweis der
exprirnierten
Die verschiedenen rekombinanten Arrestine wurden mit Hilfe des Zentrifugations-Bindungs­
Assays aufIhre Bindungseigenschaften und Spezifitat uberpruft.
Die Bedingungen der drei verschiedene Versuchsansatze variierten jeweils und sind explizit
angegeben. Die Analyse erfolgte mittels SDS-PAGE und Westernblot, da insbesondere die
Pelletproben aufgrund von kontaminierenden Proteinen aus PMBs und ROS im SDS-Gel
schwer auszuwerten sind.