Arrestin hetero/oge Expression/l Mutagenese und biophy,sikalische Untersuchungen

ERGEBNISSE
69
3.1.4.
Zentrifugations-Bindungs-Assay zurn Nachweis
Funktionalitat von in E. coli exprirnierten Arrestinen
der
Die aus den Klonen 59.7 und 26.3 gewonnene Arrestinlosung minderer Reinheit wurde im
Zentrifugations-Bindungs-Assay (2.14.) eingesetzt. Mit diesem Assay wurde die Bindung von
Arrestin an phosphoryliertes Rhodopsin in Abhangingkeit von del' Belichtung bestimmt. Es
wurden pro Ansatz -100 nM Arrestin-StrepTagI bzw, MRGS-6His-AITestin und -20 IlM
PMBs in 100 III Gesamtvo1umen eingesetzt. Die Belichtung erfo1gte 10 min auf einem
Lichttisch. Del' Test zeigt im SDS-Ge1 und Westernblot fo1gendes Ergebnis: Bei Belichtung
HiBt sich del' Hauptteil des eingesetzten Arrestin-StrepTagI im Pellet lokalisieren (Abb. 3.6.
Spuren A:l, 3, 5 und 7), im Dunkeln bleibt del' grofste Teil im Uberstand (Abb. 3.6. Spuren
A:2, 4, 6 und 8). Wenn man die im Pellet detektierbaren Mengen im Dunkeln und nach
Belichtung vergleicht, so ist del' Anteil, del' nach Belichtung bindet groBer als nach
Dunkelinkubation.
A
12345678
+ - + - + +
- 50kDa
B
c
-50 kDa
- 50 kDa
Abbildung 3.6.: Bindungsverhalten von Arrestin-StrepTagI (Klon 59.7) und MRGS-6His-Arrestin (Klon 26.3)
im Vergleich zurn Arrestin aus dcru Rinderauge anPMBs im Zentrifugations-Bindungs-Assay. Dargestellt sind Spuren aus
Westernblots nach Chemolumineszenz-Detektion tiber polyklonale anti-Arrestin Antikorper (1-4) sowie Spuren von
Coomassie gefarbten 12%igen SDS Gelen (5-8). 1., 5. Uberstand nach Belichtung; 2., 6. Uberstand im Dnnkeln;
3., 7. PMB-Pellet nach Belichtung; 4., 8. PMB-Pellet im Dunkeln
A: Arrestin-StrepTagI (Klon 59.7): B: MRGS-6His-Arrestin (Klon 26.3); C: Arrestin aus dem Rinderauge