Arrestin hetero/oge Expression/l Mutagenese und biophy,sikalische Untersuchungen

DISKUSSION
nicht moglich (3.1.1. bis 3.1.3.). Del' Hauptanteil des expnmierten Proteins (etwa 90 %)
reicherte sich in Einschlufskorpcm, bestehend aus aggregiertem Protein, an.
Eine Moglichkeit mit den untersuchten Systemen eine grolsere Menge an loslichem und
stabilem Arrestin in E. coli zu exprimieren, konnte eine Co-Expression von naturlichen,
zusatzlichcn Faltungsfaktoren, molekularen Chaperonen sein. In mehreren Fallen konnte so
del' Anteil an loslichern Protein in E. coli erhoht werden (Blum et al., 1992;
Amrein et al., 1995; Hockney et aI., 1995). Molekulare Chaperone assistieren bei del'
Proteinfaltung und beeinflussen durch ihre Menge und Spezifitat Loslichkeit und Rtickfaltung
(Haase-Pettingell & King, 1988; Mitraki & King, 1989; Krueger et al., 1990;
Gething & Sambrook, 1992; Georgopoulos & Welch, 1993).
MRGS-6His-Arrestin und Arrestin-StrepTagI wurden im Zentrifugations-Bindungs-Assay auf
ihre Bindung an Rhodopsin uberpruft, Fur Arrestin-Strep'Tagl konnte bedingt eine
Iichtabhangigc Bindung entsprechend dem wildtypischen retinalen Arrestin gezeigt werden,
jedoch laBt die Interpretation del' Resultate auf einen nicht geringen Anteil unspezifischer
Bindung oder Denaturierung schlieBen. MRGS-6His-Arrestin prazipitierte unter den
Bedingungen des Assays vollstandig (3.1.4.; Abb. 3.6.).
Gray-Keller und Mitarbeiter (1997) konnten wildtypisches und mutiertes Arrestin
(A1'I'estin-RI75E) in E. coli unter Verwendung des Vektors pTrcHis-B in BL21-Zellen
erfolgreich exprimieren. Die von ihnen angewandten Expressionsbedingungen (30°C,
12 h Induktion mit 0,02 - 0,03 mM IPTG) ftihrten mit den in diesel' Arbeit beschriebenen
Expressionssystemen jedoch zur Bildung von Einschlufskorpern. Das von Gray-Keller und
Mitarbeitern untersuchte Protein zeigte im Aktivitatstest die Eigenschaften des retinalen
Arrestins. Dies deckt sich mit den Resultaten fur Arrestin-StrepTagI (3.1.4.). Es liegen keine
Informationen von Gray-Keller tiber die Ausbeute oder das Verhalten del' rekombinanten
Arrestine bei Konzentrierung VOl', so daB unklar ist, ob das von ihnen exprimierte Protein fur
Kristallisationsexperimente verwendbar ist.
Die Expression von aktivem Arrestin in E. coli ist moglich, unter den in diesel' Arbeit
untersuchten Bedingungen war sie jedoch nur bedingt erfolgreich.
Rekombinantes Arrestin aus E. coli diente zur Aufklarung del' gerade publizierten,
verfeinerten Arrestinstruktur (Hirsch et aI., 1999). Somit ist bewiesen, daB eine funktionale
Expression dieses eukaryotischen Proteins in grofsen Mengen in dem prokaryotischen Wirt
E. coli moglich ist. Es liegen noch keine Angaben tiber die von Hirsch und Mitarbeitern
angewandten Expressions- und Reinigungsbedingungen VOl' (Schubert et al., im Druck).