Arrestin hetero/oge Expression/l Mutagenese und biophy,sikalische Untersuchungen

ERGEBNISSE 57
(Thatcher & Panayotatos, 1986; Schein & Noteborn, 1988; Kopetzki et al., 1989). Es gibt
viele experimentelle Ansatze, um die Loslichkeit von in E. coli exprimierten Proteinen zu
erhohen, jedoch mull ftlr jedes Protein erneut versucht werden ein Optimum zu finden
(Hockney, et al., 1995).
In del' Regel bringt die Produktion eines Fremdproteins einen Wachstumsnachteil Iur die
betreffende E. coli Zelle mit sich. Einige heterolog exprirnierte Proteine haben lethale Effekte
auf den Expressionsstamm. Generell ist es daher wtinschenswert, die Fremdprotcin­
Biosynthese gezielt zu regulieren, d.h. es werden Promotoren verwendet, deren Aktivitat
durch Repressoren blockiert werden konnen, Zur Produktion des Zielproteins mufs diesc
Repression jedoch in einem bestimmten Wachstumsstadium del' E. coli Zellen gezielt
aufgehoben werden, am einfachsten durch Zugabe eines nicht metabolisierbaren Induktors,
In diesel' Arbeit fanden drei verschiedene E. coli Expressionssysteme Verwendung, wobei
jedes auf einer anderen Art del' Regulation beruht.
3.1.1. Expression von Arrestin als Nvterminale Glutathion-S«
Transferase Fusion im Vektor pGEX·4T.l
pGEX-Vektoren werden in E. coli zur Expression fremder Polypeptide als N-terminale
Fusion mit Glutathion-S-Transferase (GST) verwendet. GST (26 kDa) ist ein
cytoplasmatisches, eukaryotisches Protein und wurde ursprunglich aus Schistosoma
japonicum kloniert (Smith et al., 1986). Im Allgemeinen sind diese Fusionsprodukte loslich
und konnen leicht unter nativen Bedingungen mittels GST-Affinitatschromatographie
gereinigt werden (Smith & Johnson, 1988). Eine Abspaltung des Zielproteins von del' GST
nach Expression wird bei Verwendung von pGEX-4T-l durch die sequenzspezifische
Protease Thrombin ermoglicht, deren Erkennungssequenz unmittelbar upstream del' MCS des
Vektors lokalisiert ist, Das Expressionssystem bietet den Vorteil einer induzierbaren
Expression tiber den starken tac Promotor, welcher durch das Laktose-Analogon
Isopropyl ~-D-Thiogalaktosid (IPTG) induzicrt wird. Del' Vektor enthalt das lac fl-Gen,
dessen Genprodukt, del' lac Repressor, zur negativen Regulation des Promotors notwendig ist,
Somit ist fast jeder E. coli Stamm als Wirtsstamm verwendbar. Als Expressionsstamme bieten
sich Protease-defiziente Stamme (wie E. coli BL21) an, da so die Degradation des
Zielproteins vermindert werden kann. Alternativ ermoglicht die Expression im Stamm W3110
die Erzeugung groBer Biomasse, da diesel' Stamm zu sehr hohen Zelldichten heranwiichst.