Arrestin hetero/oge Expression/l Mutagenese und biophy,sikalische Untersuchungen

26 MATERIAL UND METHODEN
Herstellung von klaren Zellysaten (Uberstdnden)
Das Zellysat wird durch Zentrifugation bei 4°C, 20000 Upm (SS34 Rotor) von den
unloslichen Bestandteilen getrennt. Kleine Partikel und Schwebestoffe werden anschlieBend
mittels Filtration durch eine 0,45 11m Filtrationseinheit aus del' Losung entfernt (Qberstand 1).
Zur Reextraktion wird das Pellet in einem halben Volumen ZellaufschluBpuffer resuspendiert
und 5 mal 1 min auf Eis mit dem Ultraschallstab behandelt. Diese Suspension wiI'd ebenso
wie zuvor das Zellysat durch Zentrifugation und Filtration von unloslichen Bestandteilen
getrennt (Qberstand 2).
2.5.1. Herstellen von Proteinextrakten aus E. coli fiir analytische
Zwecke
Die Zellen einer 25 ml Kultur werden geerntet und in 1 ml ZellaufschluBpuffer resuspendiert.
Die Zellsuspension wird 3 mal 30 sek auf Eis sonifiziert (Labsonic L von Braun, kleine Nadel
TUO). AnschlieBend werden die unloslichen Bestandteile in einer Mikrozentrifuge bei 4 °C
ftir 15 min mit 13.000 Upm durch Zentrifugation abgetrennt. Das Pellet wird erneut in 1 ml
ZellaufschluBpuffer resuspendiert und wie oben beschrieben sonifiziert. Die Analyse del'
Ioslichen und unloslichen Fraktion (Uberstand und Pellet) erfolgt mittcls SDS-PAGE (2.8.1.).
2.5.2. Selektiver Aufschlu6 des Periplasmatischen Raums von E. coli
Die Zellen einer Expressionskultur werden durch Zentrifugation geerntet (6000 Upm, 4°C,
15 min) und das Pellet in lIlOO Kulturvolumen Fraktionierungspuffer (100 mM TrislHCl
pH 8,0, 500 ruM Saccharose, 1 ruM EDTA, 0,02 % (w/v) NaN3) resuspendiert. Die
Zellsuspension fur 30 min auf Eis inkubiert. Im Allgemeincn wird unter diesen Bedingungen
die liuBere Membran von E. coli zur Freisetzung del' loslichcn Komponenten des Periplasmas
ausreichend permeabilisiert. Zur Abtrennung del' entstandenen Spharoplasten wird die
Suspension wahrend 15 min bei 4°C und 13000 Upm in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert.
Del' klare Uberstand wird vorsichtig abgenommen und in ein frisches EppendorfgefliB
iiberfiihrt. Del' periplasmatische Extrakt wird mittels SDS-PAGE (2.8.1.) und Westemblot
(2.8.3.) analysiert. Die Spharoplasten werden wie unter 2.5. beschrieben zur Herstellung von
loslicher und unloslicher Fraktion behandelt.