Arrestin hetero/oge Expression/l Mutagenese und biophy,sikalische Untersuchungen

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pers. Mitteilung), fand auch hochreines Wasser Anwendung bei ZellaufschluB und
Proteinreinigung. Der Zusatz von Additiven wie DTT (5 mM) und Triton X-IOO (0,1 % v/v)
wurde ebenfalls untersucht. Die Auswertung der Versuche erfolgte wiederum durch Analyse
von loslicher und unloslicher Fraktion (2.5.1.).
In keinem der untersuchten Puffer konnte eine maBgebliche Erhohung der Loslichkeit des
Fusionsproteins festgestellt werden.
Die Analyse der Fraktionen nach Verwendung von PBS ist in der Abb. 3.1. gezeigt. Fur
weitere Experimente wurde Arrestin-Puffer oder PBS (siehe Pharmacia-Handbuch)
verwendet. Unabhangig vom verwendeten Puffer konnte reproduzierbar das Fusionsprotein
(-80 kDa) durch wiederholte Extraktion (bis zu zehnmal) der unloslichen Fraktion (im
Folgenden als Pellet bezeichnet) in Losung gebracht werden (Abb. 3.1. Spuren 2-5). Bei
jedem Extraktionsschritt lief sich in etwa die gleiche Menge Fusionsprotein (etwa 10 %) aus
dem Pellet herauslosen. Eine Erklarung ware das Entstehen von Membranvesikeln nach dem
AufschluB der Zellen, in denen ein Teil des Cytoplasmas eingeschlossen und durch
Zentrifugation sedimentiert wird. Durch Ultraschallbehandlung offnen sich diese Vesikel. Da
die Menge an extrahierbarem Protein aber bei jedem Schritt gleich war, ist die folgende
Moglichkeit wahrscheinlicher: Wahrend der Expression wurde die Loslichkeitsgrenze des
Fusionsproteins ttberschritten, wodurch Proteinaggregate entstanden. Aus solchen Aggregaten
laBt sich ein Protein nur bis zu seiner thermodynamischen Loslichkeitsgrcnzc erneut losen,
d.h, es stellt sich bei wiederholter Extraktion immer wieder das selbe Gleichgewicht zwischen
Uberstand und Pellet ein.
M 1 2 3 4 5
97,4kDa­
66,0 kDal-
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Abbildung 3.1.: Darstellung von loslichen und unldslichen Fraktionen in PBS des Klons 9.13
(Expressionsstamm BL21::DE3 [plysS])im Coomassie gefarbten SDS Gel (15%). Spur M zeigt den HMW Rainbow Marker.
1. Pellet nach 2. Extraktion; 2. Uberstand 1; 3. Oberstand 2; 4. Uberstand 3; 5. Uberstand 5