Arrestin hetero/oge Expression/l Mutagenese und biophy,sikalische Untersuchungen

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40 MATERIAL UND METHODEN 2.8.3.2. Immunochemische Detektion Die Membran wird 1 h bei Raumtemperatur oder tiber Nacht bei 4 DC mit 10 % (w/v) Magermilchpulver in TBS abgesattigt, Die Inkubation mit Primarantikorper oder Konjugat in 10 % (w/v) Magermilchpulver in TBS erfolgt fur 1 h bei Raumtemperatur oder bei 4 DC tiber Nacht. Die Membran wird 2x mit TBS-T und Ix mit TBS fur je 10 min bei Raumtemperatur gewaschen. Die Inkubation mit Sckundarantikorper erfolgt in 5 % (w/v) Magermilchpulver in TBS fur I h bei Raumtemperatur oder liber Nacht bei 4 DC. Die Membran wird wie nach Inkubation mit dem ersten Antikorper gewaschen. Wenn das SA-AP-Konjugat gegen den StrepTag eingesetzt wird, erfolgt die Absattigung der Membran nach Herstellerangaben mit Roti-Block (Roth). Das Konjngat wird in TBS verdunnt eingesetzt. Nach Inkubation mit dem SA-AP-Konjugat wird kolorimetrisch durch Zugabe von 7,5 % (w/v) Nitrotetrazoliumblau in 70 % (v/v) Dimethylformamid und von 5 % (w/v) 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-Phosphat in Dimethylformamid detektiert (Blake et aI., 1984). Zur Chemolumineszenz-Detektion tiber Peroxidase werden die Substrate Super Signal oder Super Signal Ultra (Pierce) nach Herstellerangaben eingesetzt. Rontgenfilme (XAR oder Biomax-Ml.; Kodak) werden je nach Leuchtintensitat 10 sek bis tiber Nacht exponiert. Die Filme werden nach Herstellerangaben mit Losungen der Firma Kodak entwickelt. 2.8.3.3. "Strippen" von Westernblots Nach Chemolumineszenz-Detektion ist anschlieBend ein "Strippen" der Membran und erneute Inkubation mit Antikorpern moglich, Zum Strippen wird der Blot 2 mal 30 min bei 50 DC in Stripping-Losung unter leichtem Schwenken inkubiert. Es wird 2 mal mit TBS-T und 1 mal mit TBS gewaschen, wie oben beschrieben abgesattigt und mit Antikorperlosungen inkubiert.
MATERIAL UND METHODEN 41 2.8.3.4. Verwendete Antikilrper und Konjugate Die in diesel' Arbeit verwendeten Primar- und Sekundarantikorper sowie Konjugate sind in den Tabellen 2.3. bis 2.5. aufgelistet. Tabelle 2.3.: Primarantikorper Name Antigen I Epitop Eigenschaft Herkunft Verwendung anti GST Glutathion-S- polyklonal, Ig aus Pharmacia 1:1000 Transferase Ziege anti Arrestin Arrestin polyklonal, Ig aus 1. Weyand 1:1000,1:500 Kaninchen F4C1 AS 42-48 aus monoklonal aus L. Donoso 1:1000,1:500 Arrestin Maus A2G5 AS 360-368 aus monoklonal aus L. Donoso 1:1000 Arrestin Maus D9F2 AS 360-368 aus monoklonal aus L. Donoso 1:1000 Arrestin Maus A9C6 AS 376-386 aus monoklonal aus L. Donoso 1:1000 Arrestin Maus S6H8 AS 40-50 aus monoklonal aus J.P. Faure 1:1000 Arrestin Maus S7D6 AS 40-50 aus monoklona1 aus J.P. Faure 1:1000 Arrestin Maus S8D8 AS 40-50 aus monoklonal aus J.P. Faure 1:1000 Arrestin Maus AH 2FI Arrestin monoklonal aus J.P. Faure 1:1000 Maus Tabelle 2. 4 ... Sekundarantikbrper Name Antigen I Epitop Eigenschaft Herkunft Verwendung anti Ziege IgG aus Ziege polyklonal, Ig aus Kaninchen, Sigma 1:10000, Peroxidase konjugiert 1:20000 anti Maus IgG und IgM aus polyklonal, Ig aus Ziege, Pierce 1:10000, Maus Peroxidase konjugiert 1:20000 anti IgG aus Kaninchen polyklonal, IgG aus Ziege, Sigma 1:10000, Kaninchen Peroxidase konjugiert 1:20000
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