Arrestin hetero/oge Expression/l Mutagenese und biophy,sikalische Untersuchungen

98 ERGEBNISSE
I. Untersuchung del' GST-Arrestin Fusion sowie aus GST-Arrestin
isoliertes Arrestin im Vergleich zum Arrestin aus dem Rinderauge
Uberpruft wurde hier nur die Iichtabhangige Bindung del' Arrestine an phosphoryliertes
Rhodopsin (PMBs). Eingesetzt wurden pro Ansatz etwa 100 nM Arrestin bzw. GST-Arrestin
und etwa 20 !-1M PMBs in einem Gesamtvolumen von 100 !-II. Die Belichtung erfolgte fur
10 min auf einem Lichttisch.
Nach Belichtung war das Arrestin aus dem Rinderauge im Pellet lokalisiert (Abb. 3.18.
Spuren 7 A, B), im Uberstand lieB sich kein ungebundenes Protein detektieren (Abb. 3.18.
Spuren 1 A, B). Die gleichen Proben im Dunkeln inkubiert zeigten Arrestin im Uberstand
(Abb. 3.18. Spuren 2 A, B) und nul' geringe Mengen bzw. iiberhaupt kein Protein im Pellet
(Abb. 3.18. Spuren 8 A, B). Die entsprechende Verteilung auf Uberstaud und Pellet ist flir das
Fusionsprotein GST-Arrestin (Abb. 3.18. Spuren 5A, B; 6A, B; llA, B; 12A, B) und fur das
aus GST-Arrestin isolierte Arrestin (Abb. 3.18. Spuren 3 A, B; 4A, B; 9A, B; lOA, B) zu
finden. Im jeweiligen Pellet nach Inkubation im Dunkeln lieBen sich durch die
Westernblotanalyse geringe Mengen von Arrestin aus dem Rinderauge (Abb. 3.18. Spur 8B)
und dem Fusionsprotein GST-Arrestin (Abb.3.18. Spur 12B) detektieren. In den
Spuren 6A, B und lIB del' Abb. 3.18. ist eine geringe Menge Arrestin detektierbar (Banden
bei etwa 50 kDa), da hier wahrscheinlich mit Thrombin kontaminiertes Fusionsprotein
eingesetzt worden ist (3.3.2.1.).
Uberstande
Pellets
A
+ + + + - + + - Licht
1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 1112
-80 kDa
-50kDa
B
-80 kDa
~50kDa
Abbildung 3.18.: Resultate des Zentrifugations-Bindungs-Assays. Dargestellt sind Proben in Coomassie
gefllrbten 12%igen SDS~Gelcn (A) undin Westernblots ffi) nachInkubation mitpolyklonalem anti-Arrestin Antikdrper und
entsprechendem Sekundarantikorper mit abschlieBender Chemolumineszenz-Detektion. In der Spur Mist die 10 kDaLadder
aufgetragen. Arrestin aus clem Rinderauge: 1. Uberstand nach Belichtung; 2. Uberstand im Dunkeln; 7. Pellet nach
Belichtung; 8. Pellet im Dunkeln; Arrestin aus GST-Arrestin: 3. Uberstand nach Belichtung; 4. Oberstand im Dunkeln;
9. Pellet nach Belichtung; 10. Pellet im Dunkeln; Arrestin-GST: 5. Uberstand nach Belichtung; 6. Uberstand im Dunkeln;
11. Pellet nach Belichtung; 12. Pellet im Dunkeln