Arrestin hetero/oge Expression/l Mutagenese und biophy,sikalische Untersuchungen

ERGEBNISSE
hauptsachlich aktive Protease nach ZellaufschluB ist ill vitro die Endoprotease "Protease B"
(PrB) del' Vakuole anzusehen. Eine Eliminierung der PrB durch Mutation resultiert in del'
Stabilisierung vieler Proteine und kann die Ausbeute verschiedener Genprodukte
entscheidend verbessern (Jones, 1990; Emr, 1990). Proteolytische ill vitro Artefakte werden
u.a. durch Hitze und SDS verstarkt, wei! dadurch z.B. die PrB von ihrern Inhibitor befreit und
somit aktiviert wird (Jones, 1990; Jones, 1991; Pringle, 1975; Ulane & Cabib, 1974). Somit
kann sich z.B, auch das allgemeine Bandenmuster von Proteinextrakten im Coomassie
gefarbten SDS-Gel andern.
3.2.3.1. Wachstumsverhalten verschiedener S. cerevisiae Stiimme in Abhiingigkeit
von Medium und Kohlenstoffquelle
Die Induktion der heterologen Expression in einer Wachstumsphase mit hoher Zelldichte
kombiniert den Vorteil der guten Verwertung del' Medienbestandteile mit einer hohen
Ausbeute an induzierbaren Zellen. Eine Expression in der stationaren Wachstumsphase ist
abel' nachteilig, da insbesondere die verschiedenen Proteasen del' Hefe (3.2.) beim Eintritt in
die stationare Phase mindestens 100fach vermehrt produziert werden (Moehle et al., 1987).
Eine Induktion in del' Mitte del' logarithmischen Wachstumsphase scheint optimal, somit ist
unter diesem Aspekt derjenige Wirtsstamm del' geeignetste, del' moglichst spat und mit hoher
Zelldichte die stationare Phase erreicht,
Urn die Eignung del' beschriebenen Stamme fur die Verwendung mit den Expressionsvektoren
zu iiberpriifen (3.2.1., 3.2.2.), wurden Wachstumskurven unter variierenden Mediumsbedingungen
aufgenommen. Die Kultivierung wurde wie unter 2.4.1. beschrieben
durchgefiihrt und das Wachstum anhand del' OD600 in Abhangigkeit von del' Zeit verfolgt
(2.4.2.). Es erfolgte eine doppelte Probenentnahme pro Kolben, del' Mittelwert wurde fur die
Auswertung verwendet und ist dargestellt, Die Kulturen wurden mit einer OD600 von jewei!s
etwa 0,05 gestartet und in folgenden Medien 55 h inkubiert:
YP mit:
SC mit:
2 % Glukose (YPD)
2 % Glukose (SD)
oder 2 % Galaktose (YPG)
oder 2 % Galaktose (SG)
Das Wachstum in Vollmedium war bei allen Stammen unabhangig von del' getesteten
Kohlenstoffquelle sehr gut, es wurden nach 52 heine OD600 zwischen 10 und 25 erreicht,
Somit sind fUr Expression in Vollmedium aile getesteten Stamme geeignet. Entscheidend fur
die Stammauswahl war abel' das jeweilige Wachstum auf Minimalmedium, da die
Expressionskulturen fur Proteinreinigungen in Selektionsmedium ohne Leucin angezogen
wurden (2.6.; 3.2.3.2.).