Arrestin hetero/oge Expression/l Mutagenese und biophy,sikalische Untersuchungen

64 ERGEBNISSE
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3.1.2.1. Klonierung von Arrestin in den Vektor pQE-30
Die -1,2 kb kodierende Arrestin Sequenz wurde aus dem Konstrukt 9.13 (Arrestin im Vektor
pGEX-4T-1, 3.1.1.1.) im gleiehen Leseraster hinter die, ftir das MRGS-6His-Peptid
kodierenden Sequenzen, zwischen die BamBI und die SmaI Schnittstelle des Po1ylinkers in
den Vektor pQE-30 (Anhang) umkloniert. Der Vektor 9.13 wurde zunachst partiell mit
BamBI verdaut (3.1.1.1.) wobei das entstehende -1 kb Fragment isoliert wurde. Parallel
wurde der Klon 9.13 mit NotI linearisiert, die Einze1strangiiberhange der entstehenden,
sogenannten klebrigen Enden enzymatisch entfernt und mit Narl ein etwa -930 bp groBes
Fragment mit 5'NarI-klebrigem und 3' stumpfem Ende ausgeschnitten. Das -1 kb
BamHI-Fragment wurde in den mit BamBI aufgeschnittenen und dephosphorylierten Vektor
pQE-30 ligiert und die Orlentierung iiberprUft (Konstrukt 22.1). Dieses Konstrukt wurde nun
mit den Enzymen NarI und SmaI geschnitten, dephosphoryliert und mit dem -930 bp
Fragment ligiert (Konstrukte 26.3 und 26.4, durch Schneiden mit Restriktionsenzymen
verifiziert). Zur Expression wurde der Vektor 26.3 in den Expressionsstamm M15 [pREP4j
transformiert.
3.1.2.2. Expression und Reinigung von MRGS·6His-Arrestin im Vektor pQE-30
Die Kultivierung der Expressionskulturen wurde wie in Kapite1 2.5. beschrieben
durchgeflihrt. Zur Optimierung wurde in jeweils 200 m1 Kulturvo1umen bei Temperaturen
von 25°C, 30 °C und 37°C die Expression verfo1gt. Nach Induktion mit 0,1 mM IPTG
wurden alle 30 min bis zu maximal 5 h 15 ml-Proben entnommen. Zur Auswertung wurden
Uberstande und Pellets mitte1s SDS-PAGE ana1ysiert. Die Zellen wurden mit Bindungspuffer
aufgesch1ossen. Eine Versuchsreihe bei 37°C im Zeitraum von 1,5 h bis 3 h zeigt die
Zunahme der MRGS-6His-Arrestin Bande (bei etwa 50 kDa) in del' Pelletfraktion in
Abhangigkeit von del' Zeit (Abb. 3.4., Spuren 1,3,5,7). Diese Zeitabhangigkeit war jedoch
nieht immer reproduzierbar. Die korrespondierende Bande im Uberstand zeigt unabhangig
von del'Expressionsdauer jeweils die gleiehe Starke (Abb. 3.4. Spuren 2,4,6,8).
Die Reinigung des MRGS-6His-Arrestins aus der Ioslichen Fraktion erfo1gte analog wie in
Kapitel 2.9. (Tab. 2.6.) beschrieben. Die Eluatfraktionen enthielten neben dem
MRGS-6His-Arrestin noch kontaminierende Proteine, die Ausbeute ist sehr gering (Abb. 3.4.,
Spuren 9,10). Wahrend der Eluat-Konzentrlerung prazipitierte, wie auch bei der GST-Fusion
beobachtet, das Protein in Form von gelblichen Nadeln auf del' Membran der
Ultrafiltrationseinheit. Die Analyse des loslichen Retentats zeigt, daB die MRGS-6His­
Arrestin Konzentration im Vergleieh zur Konzentration im Ausgangs-Eluat nieht erhoht
werden konnte, obwohl das Volumen um den Faktor 4 reduziert wurde (Abb. 3.4. Spur 11, in
den Spuren 9-11 wurden equivalente Volumina aufgetragen).